PRÁCTICA: Electroforesis en gel de agarosa con ADN puro.

PRÁCTICA: Electroforesis en gel de agarosa con ADN puro.

Michua-Hernández Magali , Osornio-Lara Elizabeth, Rosas-Mani Ana Patricia, Rodríguez-Colín Jesús, Velásquez-Sánchez María Fernanda.

Universidad Autónoma Del Estado De México, Facultad de Ciencias, Laboratorio de Genética.

Resumen : La electroforesis es una Técnica que nos permite  la separación de moléculas. La electroforesis en gel es un método que se emplea para separar macromoléculas en función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas. En la práctica utilizamos la técnica de la electroforesis para separar fragmentos de DNA de cebolla y germen  de trigo. Como resultado pudimos observar las diferentes bandas  resultado del desplazamiento de los ácidos nucleicos 

Introducción

La electroforesis en gel de agarosa es un método bastante utilizado para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN. La agarosa es un polímero lineal, extraído de algas marinas, en el cual las moléculas de ADN de doble cadena migran de manera inversamente proporcional al logaritmo en base 10 (logl 0) de sus tamaños moleculares. Dado que el ADN está cargado negativamente debido a los grupos fosfatos de la molécula, la migración en la cámara de electroforesis ocurre del polo negativo hacia el polo positivo. Entre los factores que afectan la tasa de migración del ADN en los geles de agarosa (Concepción et.al.,2001).

La electroforesis en gel es un método que se emplea para separar macromoléculas  en función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas. El término electroforesis describe la migración de las partículas cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico. «Electro» se refiere a la electricidad y «foresis», del griego phoros, significa «trasladar». Así pues, la electroforesis en gel es una técnica consistente en aplicar corriente eléctrica a las moléculas para que atraviesen una placa de gel. La fuerza motriz de la electroforesis es la tensión eléctrica aplicada a los electrodos en ambos extremos del gel. Las propiedades de una molécula

determinan la velocidad con que un campo eléctrico puede desplazarla a través de un medio gelatinoso  (Somma et.al., 2005).

Muchas macromoléculas biológicas importantes (por ejemplo, los aminoácidos, los péptidos, las proteínas, los nucleótidos y los ácidos nucleicos) poseen grupos ionizables y, a un pH determinado, existen en solución como especies cargadas eléctricamente, sean cationes (+) o aniones (-). Según la naturaleza de la carga neta, las partículas cargadas migrarán hacia el cátodo o hacia el ánodo. Cuando se aplica un campo eléctrico a un gel con pH neutro, los grupos fosfato del ADN cargados negativamente lo harán migrar hacia el ánodo (Somma et.al., 2005).

La electroforesis en gel es una técnica que se emplea para separar los ácidos nucleicos y las proteínas. La separación de las macromoléculas depende de dos variables: carga y masa. Cuando una muestra biológica, como por ejemplo el ADN, se mezcla en una solución tampón y se aplica a un gel, esas dos variables actúan conjuntamente. La corriente eléctrica de un electrodo repele las moléculas, al tiempo que el otro electrodo las atrae. La fuerza de fricción del material de gel actúa  como «tamiz molecular», separando las moléculas en función de su tamaño.  Durante la electroforesis, las macromoléculas son empujadas a través de los poros, dependiendo su tasa de migración por el campo eléctrico  (Somma et.al., 2005)

Metodología

Se prepararó una solución de TEA a una concentración de 1x y dos matraces Erlenmeyer con 30 ml de gel de agarosa, con esto se garantiza que esté totalmente polimerizado al momento de utilizarlo para preservar el estado del gel se congelo hasta el día de la práctica.

Para descongelar el gel de agarosa se utilizó un horno de microondas dando tiempos de 15 s. para evitar que este reaccionara de manera violenta al contacto con el calor. Ya descongelado se agregaron 5 micro litros de bromuro de etidio.

Se colocó el  gel de agarosa en la cámara electroforética con los peines  colocados, una vez que el gel se polimerizo fueron retirados los peines y las paredes de la cámara. Se agregaron aproximadamente 900 ml de EDTA de manera que la solución cubriera totalmente al gel de agarosa.

Con una micropipeta se colocaron 10 microlitros de muestras de ADN  previamente preparadas con  5 ml de tampón de carga. Una vez que fueron colocadas las muestras se aplicó  la carga eléctrica (120 v.) para que iniciara el proceso.  Una vez que transcurrieron 30 minutos se retiro la carga eléctrica y se transporto el gel de agarosa a un lugar oscuro para poder ser leída con e transimulador de luz ultravioleta.

Resultados. 

Con muestras de ADN previamente aislado, se dispuso a poner las muestras en el gel para que por un gradiente eléctrico, las moléculas de ADN quedaran impresas en el gel de agarosa.  Y asi se pudiera ver en a través de luz ultra violeta la secuencia de ADN deseada.

[pic 1][pic 2]

Figura 1.- Imagen (A) Se puede observar una cámara encargada de separar el ADN a través de un gradiente eléctrico, la parte negra corresponde al cátodo (-) y la parte roja corresponde al ánodo (+) , la cámara contiene una solución amortiguadora la cual permite que no se desnaturalicen las moléculas de ADN, la parte que está en medio corresponde a el gel de agarosa con las muestras de ADN (Color azul - morado)en cada esquina de las muestras se puso una sustancia llamada escalera la cual va a proyectar un color especifico en caso de que exista ADN . Imagen (B) Es una guía la cual sirve para poder identificar  el número de bases que se pueden llegar a encontrar por fragmento después de haber corrido la muestra en su totalidad.

Figura 2.- Se pueden observar 3 geles de agarosa expuestos a través de la luz ultravioleta, para poder determinar la presencia de ADN en las muestras, la parte naranja es la escalera la cual indica la presencia de ADN, en este caso la presencia de ADN fue escasa  ya que solo una de las muestras corridas en el gel se torno de un color naranja.[pic 3]

Discusión

La electroforesis en gel de agarosa es un procedimiento utilizado en varias áreas de la Biotecnología, es un procedimiento analítico utilizado en laboratorios de investigación, biomédicos y forenses. De los existentes tipos de electroforesis, la electroforesis en gel de agarosa es el método más común y más utilizado. Es un método de separación frecuentemente utilizado para analizar fragmentos de ADN

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