Practica 1 biologia molecular ADN
Enviado por Mayra Ines Esquivias • 23 de Noviembre de 2015 • Ensayo • 4.687 Palabras (19 Páginas) • 353 Visitas
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INTRODUCCIÓN
OBJETIVO
El alumno adquiere el conocimiento practico de los procedimientos para el aislamiento y purificación del ADN eucariótico.
El alumno obtiene el ADN de células sanguíneas humanas.
El alumno realiza la identificación del ADN mediante espectrofotometría y electroforesis respectivamente.
El alumno conoce los distintos métodos para identificar y cuantificar el ADN.
El alumno realiza la cuantificación del ADN mediante espectrofotometría.
El alumno realiza la identificación del ADN mediante electroforesis.
EL alumno conoce los principios, fundamento y componentes principales de la PCR convencional y de la PCR en tiempo real.
El alumno aplica los conocimientos en relación a los métodos para amplificar por PCR en tiempo real, el fragmento del gen SRY humano, en muestras de ADN de sangre periférica.
El alumno amplifica un fragmento del gen SRY mediante PCR en tiempo real.
INVESTIGACIÓN TÉCNICA
Materiales, reactivos y equipo
- Muestra de sangre (tubo con anticoagulante EDTA)
- Guantes
- Tubos de eppendorf de 1.5 ml
- Micropipetas
- Puntas para micropipetas
- Gradillas
- Buffer de lisis celular
- Buffer de lisis nuclear
- Solución para precipitación de proteínas
- Isopropanol
- Etanol 70%
- Agua destilada estéril
- Micropipetas
- Vortex
- Micro centrifuga
- Termo baño
- Hidróxido de sodio 8mM
- Agarosa 1%
- TAE 1X
- Regulador de carga
- Bromuro de etidio
- Equipo de electroforesis
- Transiluminador
- Cámara
- Hielo y contenedor de plástico
- Campana de flujo laminar
- Tubos de PCR (0.2ml)
- Termociclador Light cycler 2.0
- Kit de PCR lightcycler DNA fast-start DNA master plus SYBR Green marca ROCHE para realizar una reacción de 10 μL.
- Oligonucleotidos SRY-1 y SRY-2 a una concentración de 5μM.
- DNA de sangre periférica de hombre y de mujer.
FLUJOGRAMA DEL PROCEDIMIENTO
- Aislamiento de ADN de una muestra de sangre periferica
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- Electroforesis
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- Cuantificación espectrofotométrica del ADN
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- Metodología de la amplificación del gen SRY mediante PCR en tiempo real
NOTA: realizar todo el procedimiento siguiente en hielo o a 4 ⁰C.
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Orden de adición | Reactivo | Volumen para 5 muestras (µL) |
1 | Kit de PCR Master mix | 10 |
2 | Primer SRY-1 (5µM) | 2.5 |
3 | Primer SRY-2 (5µM) | 2.5 |
4 | Agua | 22.5 |
Vol. Final | 37.5µL entre 5 muestras= 7.5 µL a cada tubo |
Condiciones del Termociclador
Número de ciclos: 40
Tiempo de Amplificación: 50 min
Desnaturalización inicial | 95ºC 10 seg |
45 ciclos: | |
Desnaturalización | 95ºC 10 seg |
Alineamiento | 58ºC 10 seg |
Extensión | 72ºC 17 seg |
Enfriamiento | 40 ºC 30 seg |
Mayra Inés Esquivias Rosas
NUA: 775099
RESULTADOS
En ésta práctica realizamos la extracción y purificamos del ADN de una muestra de sangre periférica mediante un proceso sencillo y rápido utilizando el kit.
Teniendo 10 tubos de eppendorf, de los cuales estaban marcados con un signo.
En el primero y segundo (marcados con signo de mujer y hombre) se encontraba lisis celular que es el proceso de ruptura de la membrana celular que produce la salida del material intracelular.
Otros 6 tubos estaban marcados con números del 1 al 6 en los cuales:
En el 1 había lisis celular
En la 2 lisis núcleos
En el 3 precipitación de proteínas
En el 4 isopropanol
En el 5 etanol
Y en el 6 agua
Los otros dos tubos están nuevos y esterificados.
- Colocando 300μl de sangre total en cada tubo marcado con el signo de hombre y mujer con 900μl de lisis celular.
- →Incubar en agitación por 10 minutos para después ponerlo en la centrifugadora 1 minutos a 13000 rpm.
- Quitar en sobrenadante teniendo mucho cuidado con la pastilla.
- Agregar 500μl de lisis celular que se encuentra en el tubo 1 y mezclar por pipeteo.
- Incubar por 5 minutos con agitación.
- →Y después colocar en la centrifugadora por 1 minuto a 13000 rpm y decantar.
- Agregar 300 μl de lisis núcleo (tubo 2) y homogenizar por pipeteo.
- Agregar 100 μl de precipitación de proteínas (tubo 3) y vortexear por 10 segundos.
- → Centrifugar por 4 minutos a 13000 rpm.
- Colocar el sobrenadante en los tubos nuevos y marcarlos.
- Agregar 300μl de isopropanol (tubo 4) y observar las hebras del ADN a la luz.
- → Centrifugar por un minuto a 13000 rpm y eliminar el sobrenadante.
- Agregar 300μl de etanol 70% (Tubo 5) y homogenizar.
- →centrifugar por 1 minuto a 13000 rpm y retirar sobrenadante
- Agregar 30- 50 mil de agua dependiendo del cómo se vea el ADN e incubar 30 min a 60⁰C.
Para poder separar el ADN se centrifugo la muestra y así se pudo separar de los otros componentes, quedando por encima la sustancia acuosa que es el ADN.
La mayoría de los reactivos sirven para limpiar el ADN y así poder observar el ADN a la luz.
DISCUSIÓN
La técnica para aislamiento e identificación de ADN es muy sencilla pero al ser tantos pasos se necesita una buena coordinación del equipo para poder ejecutar todos los pasos con precisión y rapidez al mismo tiempo. Lamentablemente en nuestro subgrupo al no haber buena comunicación cometimos un error pues al momento de observar a la luz el ADN no se veía muy bien, sino que se observaba muy poco ADN, este error talvez de cometió al no quitar todo el sobrenadante en uno de los primeros pasos, por temor a no perder la pastilla. Por lo que al usar esta muestra en la siguiente practica de PDR o en electroforesis tendremos también errores.
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