PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE LOS HOMOGENIZADOS DE LAS MUESTRAS DE ALIMENTOS

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1. ANÁLISIS:

PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE LOS HOMOGENIZADOS DE LAS MUESTRAS DE ALIMENTOS

El procedimiento comúnmente empleado para el aislamiento y recuento de los microorganismos presentes en los alimentos consiste en la preparación de los homogenizados de alimentos y de microorganismos que permita la preparación de las diluciones que posteriormente serán utilizadas en diversos métodos de recuento.

Reactivo:   Diluyente:   Agua peptonada al 0.1% (reactivo1)

Se utiliza para tratar de recuperar los posibles microorganismos presentes en las muestra sin producirles daño celular.

Procedimiento:

1. Mezclar bien la mezcla para asegurar su homogenización, antes de preparar las diluciones.

      Si se trata de productos grasos, llevarlos al baño maría a 45-50º C, para fundir la  

      muestra, agitando frecuentemente. Si se trata de  productos líquidos, agitar

      Vigorosamente. Moviendo 25 veces el antebrazo, para formar un arco de 30 °C.

      Desinfectar con alcohol al 70% el sitio por donde se vaya a extraer la muestra.

1. Abrir aséptica y adecuadamente la muestra.
2. Preparar diluciones consecutivas de la muestra (10-1, 10-2, 10-3   …) según el criterio establecido para cada una de ellas.
3. Preparar la dilución 10-1 de muestras líquida, midiendo 11 ml de la muestra en un frasco de dilución que contenga 99 ml del agua peptonada al 0.1%

Para alimentos con un alto contenido en grasa (superior al 20%), es necesario añadir un 1% de tween 80 o de otro tensoactivo no tóxico.

1. Mezclar y pesar 11g representativos de la muestra total, en el frasco de dilución conteniendo 99 ml de agua peptonada al 0.1% previamente tarado para obtener una dilución 10-1
2. Agitar vigorosamente el frasco, dejar reposar por 10 min.
3. Preparar la dilución 10-2, transfiriendo 1 ml de la dilución 10-1, con pipeta de 1 ml a un tubo de dilución que contenga 9 ml de agua peptonada al 0.1%, agitar cuidadosamente.
4. Repetir estos pasos hasta  obtener el número de diluciones necesarias.  Cada dilución sucesiva disminuirá 10 veces la concentración.

El rango de diluciones preparadas puede modificarse en función a la cifra de microorganismos esperada.

RECUENTO DE MESOAEROBIOS  

Técnica: Recuento en placa

Medio de cultivo:   Agar plate count (medio 1)

Procedimiento:

1. Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado.
2. Transferir alícuotas de 1ml. De cada una de las diluciones consecutivas en cajas de petri estériles.
3. Verter en las cajas de petri 15 ml. De Agar plate count fundido y mantenido a 45°C.
4. Mezclar el inóculo con el medio de cultivo fundido.  No debe transcurrir más de 20 minutos entre la realización de las diluciones y el vertido del medio.  La manera mas indicada de mezclar el inóculo con el medio es la siguiente:

1. Mover la caja de arriba hacia abajo 5 veces.
2. Rotar la caja 5 veces en el sentido de las agujas de reloj.
3. Mover la caja 5 veces haciendo ángulo recto sobre el movimiento (a).
4. Rotar la caja 5 veces en el sentido contrario a las agujas del reloj.

1. Hacer control de esterilidad del medio de cultivo incubando una caja que contenga agar Plate Count.
2. Hacer control de esterilidad del agua peptonada 0.1% incubando una caja que contenga 1 ml de agua peptonada y Agar Plate Count.
3. Una vez solidificado el medio, invertir las placas e incubarlas a 35°C ±2°C durante 48 horas.

Nota: El recuento de mesoaerobios también puede realizarse por la técnica de filtración por membrana descrita más adelante en el ítem referente al recuento de coliformes totales y fecales.

RECUENTO DE  COLIFORMES  TOTALES Y FECALES

Técnica:   Recuento en placa  

Medio de cultivo:   Agar Cromocult (medio 2)

Procedimiento:

1. Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado.
2. Transferir alícuotas de 1ml. De cada una de las diluciones consecutivas en cajas de petri estériles.
3. Verter en las cajas de petri 15 ml. De Agar Cromocult fundido y mantenido a 45°C.
4. Mezclar el inóculo con el medio de cultivo fundido.  No debe transcurrir más de 20 minutos entre la realización de las diluciones y el vertido del medio.  La manera mas indicada de mezclar el inóculo con el medio es la siguiente:

1. Mover la caja de arriba hacia abajo 5 veces.
2. Rotar la caja 5 veces en el sentido de las agujas de reloj.
3. Mover la caja 5 veces haciendo ángulo recto sobre el movimiento a).
4. Rotar la caja 5 veces en el sentido contrario a las agujas del reloj.

1. Hacer control de esterilidad del medio de cultivo incubando una caja que contenga agar Cromocult.
2. Hacer control de esterilidad del agua peptonada 0.1% incubando una caja que contenga 1 ml de agua peptonada y Agar Cromocult.
3. Una vez solidificado el medio de cultivo, invertir las placas e incubarlas a 35°C ±2°C durante 48 horas.

Técnica: Filtración por membrana  

Tipos de muestras: sólo para muestras  de aguas y líquidos de enjuague de envases

Medio de cultivo:   Agar Cromocult (medio 2)

Procedimiento:

1. Prepare el medio de cultivo y vierta en las placas y deje solidificar.
2. Agite vigorosamente la muestra, moviendo 25 veces el antebrazo, para formar un arco de 30 °C y garantizar la homogeneización de la muestra.
3. En el equipo de filtración por membrana estéril, coloque el filtro de membrana y vierta la muestra, dependiendo del origen y del tipo de tratamiento dado a la misma y del nivel de contaminación, adicione 20, 50 ó 100 ml de muestra para poder realizar el recuento.
4. Encienda la bomba de vacío, proceda a filtrar.
5. Transcurrido el tiempo de filtración, con una pinza estéril saque el filtro de membrana del equipo y colóquelo encima del medio de cultivo.
6. Invierta las placas e incúbelas a 35°C ±2°C durante 48 horas.

DETERMINACIÓN DE COLIFORMES  TOTALES

Técnica: Número más probable (NMP)

Medios de cultivo:   Caldo lactosado bilis verde brillante al 2% (Medio 7)

 Agar Eosina azul de metileno (EMB) (medio 8)

Agar violeta rojo neutro bilis (VRBA) (medio 10)

Agar Endo (medio 9)

Procedimiento:  

Preparar las muestras y las diluciones de los homogenizados como se ha recomendado.

El número de diluciones depende del grado de contaminación supuesto en la muestra y/o de los estándares microbiológicos del producto.  Si no se tiene experiencia con el tipo de muestra a analizar que indique el número apropiado de diluciones, se recomienda preparar un número de 5.

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