Efecto de la incorporación de diferentes aditivos al buffer fosfatos

Figura 1. Efecto de la incorporación de diferentes aditivos al buffer fosfatos de sodio 20 mM pH 7,0 sobre la cantidad de proteína extraída y la actividad de poligalacturonasa. A-NaCl 1,0 M; B-Tritón 1%; *-cisteína 20 mM; §-diálisis. Letras diferentes indican diferencias significativas de acuerdo a la prueba de Tuckey (p = 0,05).

Al comparar la capacidad extractora se observa que, el Tritón es mejor extractante que el NaCl. Por ser el Tritón un detergente, que genera un efecto surfactante es capaz de romper todo tipo de tejidos y como consecuencia extrae mayor cantidad de proteína asociada a la pared celular (Pathak y Sanwal, 1998). La actividad específica expresada en nmol/s*g corteza no se vió afectada por el tipo de extractante, por lo que se podría decir que el uso de cualquiera de éstos es indiferente. Sin embargo, al expresar la acti-vidad no referida a g de corteza sino a mg de proteína se observa que el NaCl es un extractante más selectivo hacia la extracción de PG. La posible interferencia que podría ejercer el Tritón sobre la actividad de PG queda descartada al observar que la actividad del extracto con Tritón dializado es significativamente igual a la de su homólogo sin dia-lizar. Este comportamiento es similar al observado en banano, en donde la adición de un detergente no iónico como el Tritón X-100 no altera significativamente la actividad de las tres isoformas de PG, contrario a lo que ocurre con la adición de detergentes sul-fónicos (como el Teepol) y catiónicos (como el CTAB) los cuales inhiben la actividad de alguna de las tres isoformas hasta en un 40% (Pathak y Sanwal, 1998). Hasta el mo-mento se ha analizado que el NaCl es mejor extractante que el Tritón. Ahora, para deter-minar la necesidad del empleo de la cisteína se puede realizar una comparación entre los extractos de NaCl con y sin cisteína; se observa que no hay un efecto significativo ni en la cantidad de proteína extraída, ni en la actividad específica, por lo que se consideró innecesario el uso de cisteína en la extracción. Por otro lado, al analizar la incidencia de la diálisis, se observa que tampoco hay un efecto significativo ya que la actividad espe-cífica no disminuye, por lo que el proceso de diálisis no es necesario. En este punto, al haber determinado que es mejor el empleo de NaCl sin cisteína y sin diálisis, en la extrac-ción, se procedió a evaluar cuál era la concentración de NaCl más apropiada. En la figura 2 se observa que, para las diferentes concentraciones de NaCl, la cantidad de

mg proteína/g corteza Act.espec. (nmol/s*g corteza) Act.espec. (nmol/s*mg proteína)

8

7

6

5

4

3

2

1

0

A*

b

a

a

b

a

a

b

...