CHAGATEK ELISA (BIOMERIEUX)

CHAGATEK ELISA (BIOMERIEUX)

FUNDAMENTO

CHAGATEK ELISA es un enzimoinmunoensayo (ELISA) en microtiras basado en el método indirecto para la detección de Ac anti-T cruzi en muestras de suero o plasma humano.

Luego de una dilución apropiada de las muestras, estas se incuban en los pocillos de las microtiras de poliestireno, recubiertos con Ag purificados de T. cruzi

Los Ac anti-T cruzi son específicamente capturados por los Ag pegados en los pocillos, quedando unidos a la fase sólida. Luego del proceso de lavado para la eliminación de las inmunoglobulinas no unidas, se incuba con Ac monoclonales anti IgG humana conjugado con peroxidasa. Este conjugado reacciona específicamente con los Ac anti-T cruzi inmunocapturados. El conjugado no unido se elimina por proceso de lavado y se revela la presencia de peroxidasa mediante el agregado de una mezcla de peróxido de hidrogeno y tetrametilbencidina (TMB). Esta incubación da por resultado la aparición de un color azul, cuya intensidad depende de la concentración y de la afinidad de los Ac anti- T cruzi de la muestra. La reacción enzimática se detiene mediante el agregado de ácido sulfúrico, produciendo un viraje del color azul al amarillo. El desarrollo de un color leve o nulo, indica la ausencia de niveles detectables de anti –T cruzi en la muestra.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

1. VISUAL:

El control negativo debe ser incoloro o celeste tenue. El control positivo debe presentar un color celeste claramente diferenciable respecto de los controles negativos.

Las muestras incoloras o con coloración similar a las de los controles negativos, se consideran no reactivas. Las muestras que presenten una coloración más intensa claramente diferenciables se consideran reactivas.

1. ESPECTROFOTOMETRICA

Proceder a la lectura de las tiras, siguiendo las instrucciones del lector

Luego de la lectura espectrofotométrica de los resultados se procederá al cálculo del valor de cut-off a partir de las densidades ópticas (DO) de los controles negativos.

Cut-off=DO promedio de los controles negativos + 0,100

Una muestra es considerada NO REACTIVA si su DO es inferior al valor del cut-off.

Una muestra es considerada REACTIVA si su DO es igual o superior al valor del cut-off.

VALIDACION DE LOS RESULTADOS

Una prueba se considera valida si:

• La DO promedio de los controles negativos es menor a 0,250
• La DO del control positivo menos la DO promedio de los controles negativos es igual o mayor a 0,150
• Eliminar cualquier control negativo con DO mayor a 0,250
• Si se ha eliminado algún control negativo, volver a calcular el promedio de los controles negativos. Una corrida es válida si quedan más de la mitad de los controles negativos.
• Si no se cumplen las condiciones de validación mencionadas deberá repetirse el test.

SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD

El CHAGATEK ELISA presenta una sensibilidad del 100% asumiendo una prevalencia del 100% en la presencia de Ac Ig G específicos detectables por otras técnicas como IFI, HAI y AD y una especificidad superior al 99%.

      ALGORITMO

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TREPANOSTIKA TP recombinant (BIOMERIEUX)

INTRODUCCIÓN

Las pruebas serológicas son importantes herramientas en el diagnóstico clínico de la sífilis. Los individuos infectados con la espiroqueta T pallidum producen distintos Ac. Rutinariamente se emplean pruebas VDRL y RPR y utilizan Ac de cardiolipina no específicos como Ac objetivo. Los Ac específicos para el T pallidum pueden detectarse, por ejemplo, mediante la prueba de hemaglutinación de Treponema (TPHA).

También puede lograrse una detección eficaz de Ac de T pallidum específicos utilizando la técnica de inmunoanálisis de enzimas sensibles.

FUNDAMENTO

El Trepanostika TP recombinant es un análisis ELISA basado en un principio de “sándwich” de un paso.

Es una técnica de inmunoanálisis ligado a enzimas en fase solida diseñado para medir los niveles de anti-Treponema pallidum en sueros o plasmas humanos. Utiliza Ag de T pallidum recombinantes acoplados a peroxidasa del rábano (HRP), que actúa como conjugado, y tetrametilbencidina (TMB) y peróxido como substrato. Específicamente, los pocillos microelisa se recubren con Ag de T pallidum recombinante. Se añade una muestra o un control adecuado que contenga Ac anti T pallidum a los pocillos microelisa. En presencia de Ac para el T pallidum se forma un complejo antigénico en fase solida Ag/marcado por la enzima/anti T pallidum. Tras un procedimiento de lavado e incubación con substrato de TMB aparece un color azul que cambia amarillo cuando se detiene la reacción con ácido sulfúrico. Aparece un color intenso si en la muestra hay presencia de Ac para el T pallidum. Sin embargo, el color será leve o inexistente tras la adición de substrato si la muestra carece de Ac anti T pallidum.

TIPO DE MUESTRAS

Puede utilizarse suero o plasma humanos.

No se han observado efectos adversos utilizando citrato, heparina o EDTA como anticoagulantes. El uso de otros anticoagulantes puede afectar al resultado del análisis.

RESULTADOS

CALCULO MANUAL

Deben realizarse por separado los cálculos para cada soporte de tiras.

NC= Absorvancia del control negativo

PC= Absorvancia del control positivo

Calificación de los valores NC/PC

1. NC debe ser < 0,300. Eliminar cualquier NC ≥ 0,300
2. Determinar el valor medio (NCx) de los controles restantes.
3. NC debe ser ≤ 1,4NCx. Eliminar cualquier NC > 1,4NCx y volver a calcular NCx.
4. NC debe ser ≥ 0,6NCx. Eliminar cualquier NC < 0,6NCx y volver a calcular NCx.
5. Repetir los pasos 3 y 4 hasta que no se encuentren más datos aberrantes.

VALIDEZ DE LA PRUEBA

Un ciclo de prueba e valido si:

1. Más de la mitad del número de controles negativos sigue siendo válido.
2. PC – NCx ≥ 0,600

          VALOR DE CORTE

        Si el ciclo de prueba es válido, calcular el valor de corte NCx + 0,350

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