Características de un “Primer”

Características de un “Primer”

Especificidad

La especificidad de los primers es en parte dependiente de su longitud. Los primers

Deben ser elegidos de modo que tengan una secuencia única dentro del DNA que será amplificado. Un primer diseñado con una secuencia altamente repetida dará lugar a productos no deseados. Sin embargo, el mismo primer puede dar una sola banda si se amplifica una sola clona de una biblioteca genómica.

Secuencias Complementarias del primer

Los primers necesitan ser diseñados con menos de 3 pares de bases de homología

Entre ellos. Si un primer tiene tal región de homología se formarán estructuras parciales de doble cadena que interferirán con el alineamiento. Si la homología ocurre en el extremo de cualquier primer, ocurrirá la formación de dímeros de primer que, a menudo, prevendrá la formación del producto deseado por competición.

Contenido de G/C

La temperatura de asociación de los primers es uno de los factores más determinantes de la reacción. Se recomienda que se emplee como temperatura de asociación la temperatura de fusión -5ºC, aproximadamente. Existen muchos métodos para calcular la temperatura de fusión, pero siempre, después de efectuado el cálculo es necesario ir al laboratorio y ensayar con diferentes temperaturas de asociación cercanas a la temperatura de fusión para determinar la temperatura óptima para cada reacción.

La composición base de los primers

Debe estar entre el 45% y el 55% de G/C. La secuencia de los primers debe ser elegida de tal forma que no haya regiones de poliG o de poliC que pueden promover el reconocimiento no específico. Las regiones poliA y poliT deben también ser evitados ya que interfieren con el complejo del primer-templado. Esto puede bajar la eficacia de la amplificación. El primer tendrá un contenido de G/C del 50% y ~20 bases de largo. Esto pondrá la Tm en la gama de 56°C – 62°C.

Secuencia de los extremos 3′

Es establecido que la posición terminal 3′ en primers de PCR es esencial para el control del “mispriming”. La inclusión de un residuo de G o de C en el extremo 3′ de los primers ayuda a asegurar el correcto enlace en el extremo terminal 3′ debido al enlace de hidrógeno más fuerte de los residuos G/C. También ayuda a mejorar la eficacia de la reacción reduciendo al mínimo la respiración que pudo ocurrir.

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