ANÁLISIS DE TRANSCRIPCIONES RNA EN PACIENTES DE LEUCEMIA CRÓNICOS MYELOID

ANÁLISIS DE TRANSCRIPCIONES RNA EN PACIENTES DE LEUCEMIA CRÓNICOS MYELOID

EXTRAIGA

La naturaleza de híbrido BCR/ABL mRNA fue analizado por RT-PCR en células de 33 pacientes (22 machos, 11 hembras) con la leucemia crónica myeloid (CML). B3a2 mRNA fue encontrado en 14 casos, mientras que 13 pacientes tenían b2a2 mRNA y seis tenía ambas clases de mRNA, con un predominio del tipo de b3a2. El tipo de presente de mRNA no mostró ninguna correlación significativa con la edad, el nivel de hemoglobina, el número de leucocitos y plaquetas, porcentaje de ráfagas o basophils o la presencia de splenomegaly en el diagnóstico. No había también ninguna correlación con el sexo o la duración de la fase crónica. Cuando estos resultados fueron combinados con aquellos hechos un informe por otros grupos, una asociación significativa (P = 0.029) fueron observados para el tipo de mRNA contra el sexo, con un predominio de hombres en los grupos que expresan b2a2 (2.68:1) y b3a2 (1.33:1). Concluimos que la clasificación de pacientes según el tipo de mRNA no homogeneiza los datos clínicos y hematological dentro de grupos, donde la discrepancia es grande, tampoco esto permite a una diferenciación entre grupos.

La Introducción

La leucemia Crónica myeloid (CML) es una enfermedad clonal caracterizada por la presencia del gene híbrido BCR/ABL, por lo general localizada sobre el cromosoma de Filadelfia que es resultado del desplazamiento recíproco entre cromosomas 9 y 22. Dos tipos principales de mRNA (b2a2 y b3a2) pueden ser producidos de este gene. Estas transcripciones, que también pueden ser co-expresadas por el empalmar de alternativa, se diferencian por la presencia de BCR exon 14 (exon b3 sobre el gene híbrido). La proteína 210-kDa traducida de estos mRNAs ha aumentado tyrosine kinase la actividad, que juega un papel crucial en leukemogenesis (Shtivelman et al., 1985; Lugo et al., 1990).

Algunos informes han sugerido un papel para exon b3 en la evolución de CML (Molinos et al., 1991b). La presencia de exon b3 ha sido asociada con parámetros de sangre anormales como altas cuentas de plaqueta (Inokuchi et 1991 Al-.; Verschraegen et al., 1995; Pastor et al., 1995), un porcentaje bajo de células de ráfaga circulantes, y altas cuentas de leucocito (Zaccaria et al., 1995). Alto leukocytosis es asociado con splenomegaly. Cuentas de plaqueta elevadas (cortado = 700,000/ml) y un bazo ampliado son correlacionadas con un pronóstico malo, mientras que la parte de enfrente es observada cuando el porcentaje de células de ráfaga circulantes es bajo.

Estos tres parámetros (cuentas de plaqueta, difundiendo el porcentaje de ráfaga y el tamaño de bazo) son usados para determinar el índice de pronóstico Sokal (Sokal et 1984 Al-.,). Otros estudios, sin embargo, no han mostrado ninguna asociación significativa entre el tipo de mRNA y los indicadores clínicos o de laboratorio de CML (Fioretos et al., 1993; Zaccaria et al., 1993; Yin et al., 1995). En este estudio, usamos RT-PCR para investigar. el tipo de mRNA presenta en 33 pacientes con CML y analizado la correlación entre los datos moleculares y el hematological y conclusiones clínicas.

MATERIAL y MÉTODOS

Pacientes de muestras

La sangre periférica fue recogida de 31 pacientes con un diagnóstico clínico y cytogenetic de CML, y de dos pacientes con sólo un diagnóstico clínico. Todos los pacientes fueron asistidos en el Hospital de Clínicas de Puerto Alegre. Dos de los pacientes tenían la sangre tranquila sobre más que una ocasión durante la fase crónica de la enfermedad, y en tres muestras de casos fue recogida durante el crónico y la fase subsecuente aguda. Once de los pacientes eran hembras y 22 eran machos, con una edad tacaña de 36.5 años (12-60 años) en el diagnóstico. La mayor parte de los pacientes recibieron chemoterapy convencional (hydroxyurea o busulfan), y 10 de ellos fueron tratados con el interferón - un durante menos de 6 meses, sin la remisión karyotypic. Células mononucleares estuvieron preparadas de muestras de sangre periféricas que usan un Ficoll-Hypaque (Histopaque, Sigma la Compañía Química, San Louis, MO) el gradiente. Las células fueron almacenadas en el nitrógeno líquido antes del empleo.

Nucleic preparación ácida y transcripción inversa.

El ARN total celular fue extraído de células congeladas con Trizol (Gibco BRL, la Magnífica Isla, Nueva York) según las instrucciones del fabricante. El ARN fue suspendido de nuevo en 20 ml de agua estéril trató con diethylpyrocarbonate (DEPC, Sigma). cDNA fue generado de 8 ml de ARN total, usando hexamers arbitrario y un primer hilo cDNA el equipo de síntesis (Pharmacia Biotech, la S ã la o Paulo, SP, Brasil).

Reacción en cadena de polimerasis (PCR)

La mezcla de reacción contuvo 2.5 ml cDNA100 mm de cada dNTP, 10 mm Tris-HCl, pH 8.3, 1.5 mm MgCl2, 2.5 U Taq polimerasis (Cenbiot/RS, Puerto Alegre RS, Brasil) y 1 mm de cada cartilla en un volumen final de 25 ml. La cartilla de antisentido sacada de exon a2 de ABL era 5'CTCCACTGGCCACAAAAT3 ' y la cartilla de sentido sacada de exon b2 de M-bcr era 5'TTCAGAAGCT TCTCCCTG3 ' (el León et al., 1991). Las muestras fueron recubridas del aceite mineral seguido de 35 ciclos de PCR en un Pharmacia thermocycler. El ADN era desnaturalizado por al principio calentando las muestras en 93oC durante 2 minuto, y luego para 40 s en ciclos subsecuentes. Permitieron a cartillas para templar en 60oC para 30 s y la extensión de hilo fue hecha en 72oC para 40 s, con un paso de extensión final de 7 minuto.

Una parte alícuota (0.5-2.5 ml) de esta primera amplificación más lejos fue amplificada por una segunda ronda de PCR la utilización de 1 mm de la cartilla de exon b2 de M-bcr (5'TTCAGAAGCTTCTCCCTGACATCCG3 ') y exon a2 de ABL (5'CTCCACTGGCCACAAAAT CATACAG3 ') (Trka et al., 1995). La reacción condiciona para esta segunda ronda de amplificación complicada: firme con las iniciales denaturation (2 minuto) en 93oC seguido de 35 ciclos de denaturation en 93oC para 40 s, que templa en 60oC para 40 s, y la extensión en 72oC durante 1 minuto con un paso de extensión final en 72oC para 7 minuto. Un control negativo (el agua en vez de cDNA) fue incluido en todas las reacciones.

Todas las muestras fueron amplificadas sobre al menos dos ocasiones diferentes para confirmar los resultados. En casos donde ninguna amplificación fue obtenida durante la primera ronda de PCR, el cDNA fue probado en un PCR con cartillas de b-actin (Schulze et al., 1995) (control) para evaluar la integridad de la molécula de ARN.

Las partes alícuotas (8 ml) de los productos PCR fueron controladas sobre el 2 % nucleic el ácido (NA) agarose (Pharmacia Biotech) geles que contienen ethidium el bromuro y marcadores de peso moleculares (la escala de par de 100 bases; Pharmacia Biotech). Las cartillas usadas en las dos rondas de PCR especificaron un fragmento 327-bp del b3a2 mRNA, y un fragmento 246-bp en ausencia de exon b3.

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