AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE LÍPIDOS

UNIVERSIDAD DE SUCRE

FACULTAD DE EDUCACION Y CINCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA Y QUIMICA

PROGRMA DE BIOLOGIA

LABORATORIO DE BIOQUIMICA II

GUIA DE LABORATORIO PRÁCTICA NO 5:

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE LÍPIDOS

1. OBJETIVOS

• Identificar algunos lípidos contenidos en la yema de huevo
• Aplicar la técnica de cromatografía para esta separación
• Reconocer los lípidos separados mediante el empleo de un revelador, el cual puede variar con la clase de lípido.
• Comparar los lípidos separados con muestras patrones o también por sus valores de Rf.

2. ASPECTOS TEÓRICOS: Los lípidos de la yema de huevo están exclusivamente asociados con los ensambles lipoproteínicos. Están hechos 62% de triglicéridos, 33% de fosfolípidos y menos de 5% de colesterol. Los carotenoides representan menos del 1% de los lípidos de la yema, y le dan el color a la misma. Las proteínas están presentes como proteínas libres o como apoproteínas (incluidas en los ensambles lipoproteínicas). Las interacciones entre los lípidos y las proteínas resultan de la formación de lipoproteínas (baja y alta densidad), que representan el principal componente de la yema. De tal manera, en base a su materia seca, la yema está constituida de cinco componentes mayores: 68% de lipoproteínas de baja densidad (LDL), 16% de lipoproteínas de alta densidad (HDL), 10% de proteínas globulares (livetinas), 4% de fosfoproteínas (fosvitin), y 2% de proteínas menores.

La cromatografía se define como la separación de una mezcla de dos o más compuestos por distribución entre dos fases, una de las cuales es estacionaria y la otra una fase móvil. Varios tipos de cromatografía son posibles, dependiendo de la naturaleza de las dos fases involucradas: sólido-liquido (capa fina, papel o columna), liquido-líquido y gases-liquido (fase vapor). En nuestro caso el tipo de fue cromatografía utilizada fue de capa fina o columnas (placa con silica-gel). Es una técnica muy importante para la separación rápida y el análisis cualitativo de muestras en pequeña cantidad. El solvente asciende por capilaridad por un soporte de vidrio (cromatoplaca) que tiene adherido el adsorbente de espesor variable. En un extremo de la placa se siembra la muestra en forma puntual y luego se introduce en una cuba que contiene el solvente de desarrollo, el cual asciende y permite que se lleven a cabo los equilibrios de adsorción- desadsorción. La placa se deja hasta que el solvente llegue al extremo superior, y terminado el desarrollo, se retira la placa, se seca, se revela y evalúa.

Todas las técnicas cromatograficas dependen de la distribución de los componentes de la mezcla entre dos fases inmiscibles: una fase móvil, llamada también activa, que transporta las sustancias que se separan y que progresa en relación con la otra, denominada fase estacionaria. La fase móvil puede ser un líquido o un gas y la estacionaria puede ser un sólido o un líquido.

Las apariciones de los líquidos se reconocen con la ayuda de un revelador, el cual reacciona químicamente con la estructura lipídica, apareciendo un producto coloreado. La identificación de la estructura lipídica se realiza comparándola con muestras patrones de lípidos puros, o por vapores de sus constantes Rf, el cual se define como la relación entre las distancias del solvente y el compuesto. I

El valor de Rf depende de las condiciones en las cuales se corre la muestra (tipo de adsorbente, eluyente, así como las condiciones de la placa, temperatura, vapor de saturación, etc."). Tiene una reproducibilidad de 20%, por lo que resulta mejor correr duplicados de la misma Placa.

1. MATERIALES EMPLEADOS:

• Extracto lipídico de la yema de huevo,
• Placas recubiertas con silica gel,
• cubas cromatograficas,
• cloroformo,
• tripolina,
• lecitina,
• colesterol,
• yodo,
• mezcla de H2SO4 y anhídrido acético

1. PARTE EXPERIMENTAL:

1. Se utiliza un extracto lipídico preparado previamente a partir de la yema de huevo.
2. Se aplican gotas (3μl) de cada una de las siguientes muestras sobre una placa cromatográfica, con ayuda de un capilar, como se indica en la figura 1

[pic 1]

Tiempo 0 Después de 10 minutos

Muestra 1: gotas de Fosfatidilcolina (PL)

Muestra 2: gotas de Colesterol libre (CL)

Muestra 3: gotas de Ácido oleico (AG)

Muestra 4: gotas de Trioleina (TG)

Muestra 5. gotas de Oleato de colesterol (CE)

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