ANALISIS DE LA MUTACION DELTA 32 DEL GEN CCR5 EN PACIENTES CON VIH/SIDA

MUTACION DELTA 32 DEL GEN CCR5 EN PACIENTES CON VIH/SIDA,ORIGINARIOS DE SINALOA

*Jesús Salvador Velarde Félix1,4, Silvestre Guadalupe Cázarez Salazar2,4, Selene de Jesús Acosta Cota3, Vicente Olimón Andalón1, Ignacio Osuna Ramírez2,3, Héctor Rangel Villalobos5.

1. CA. Inmunogenética y Evolución de la Unidad Académica Escuela de Biología-UAS, , 2. Maestría en Ciencias Biomédicas, 3. Facultad de Ciencias Químico-biológicas-UAS, 4. Hospital General de Culiacán 5. Centro de Investigación en Genética Molecular, Centro Universitario de la Ciénega, Universidad de Guadalajara (CUCiénega-UdeG). Guadalajara, México.

Unidad Académica Escuela de Biología. Ciudad Universitaria; Tel. 7161139. Email: jsvelfe@hotmail.com

Introducción

El virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) infecta de forma selectiva a las células del sistema inmune CD4+. La entrada del virus a la célula está mediada por la unión específica entre la proteína viral gp120 y dos moléculas presentes en la membrana de la célula diana, el receptor CD4 y un receptor de quimiocinas que actúa como co-receptor viral1.

Por otra parte, existe una extensa literatura que pone de manifiesto que los individuos expuestos a un agente infeccioso no siempre desarrollan la enfermedad y, cuando lo hacen, no todos responden de una misma forma a la infección2. Este fenómeno puede explicarse por diversas razones, entre las cuales se encuentra la diferente constitución genética en cada individuo3. La complejidad de los mecanismos implicados en la respuesta del hospedero contra un agente infeccioso es un reflejo del enorme número de genes implicados en la misma.

No sería posible plantear la existencia de un componente genético en la infección por VIH-1 si no existiera una variabilidad entre los individuos, tanto en lo referente a la vulnerabilidad a padecer la infección como a la presentación clínica de la enfermedad. La existencia de dicha variabilidad fenotípica es la que nos permite considerar que una parte de la misma se deba al componente genético del huésped.

La vulnerabilidad a presentar la infección por el VIH-1 y la progresión inicial a SIDA pueden verse afectadas por variaciones en los genes que codifican los coreceptores virales4,5. Poco tiempo después de que mostró que CCR5 se comportaba como co-receptor, junto con el CD4, al menos para el VIH-1, el alelo mutante CCR5Δ32, (Delta 32) el cual se caracteriza por una deleción en el único exón codificador, fue identificado en individuos caucásicos6,7. Este alelo lleva una deleción de 32 pares de bases que previene la invasión celular por la cepa transmisora primaria de VIH-1. La mutación CCR5Δ32 conduce a la pérdida de la actividad del receptor, y se ha visto que en estado homocigoto para el alelo mutante confiere resistencia a la infección no obstante la exposición repetida6,8.

En otras palabras, CCR5Δ32 produce una proteína no funcional, lo que explica la protección contra la infección en individuos homocigotos para el alelo. Casos raros de infección con VHI-1 en ausencia en ausencia de CCR5 se han reportado9-11.

En México, Zúñiga JA y cols.en individuos mestizos sanos no encontraron la mutación a diferencia del 1.9% de heterocigotos en pacientes con artritis, así como tampoco en grupos indígenas12, a diferencia del estudio de Salas-Alanis JC y cols, que encontraron un 4.4% de heterocigotos en 103 estudiantes mexicanos-hispanos de Nuevo León; en esta misma población se identificó solamente un individuo homocigoto para la mutación13. En un estudio más reciente Valadez GN y cols, encontraron un 6.2% de heterocigotos en población general originaria de Yucatán, así como en un 17.7% en un grupo de pacientes VIH+ en esta misma población14. En otro estudio se encontró en 126 controles sanos 3% de heterocigotos15. En pacientes con VIH/SIDA registrados en el Centro Ambulatorio para la Atención del sida y otras infecciones de transmisión sexual CAPASITS de la Secretaría de Salud, se buscó la mutación Delta 32 del gen CCR5 y se correlacionó con su estatus inmunológico, es decir niveles de carga viral y subpoblación de linfocitos T CD4+ para determinar su potencial como factor predictor de la enfermedad y/o infección.

Material y Métodos

a) Sujetos bajo estudio

Se realizó un estudio de casos y controles no pareado en el Hospital General de Culiacán Dr. Bernardo J. Gastélum, entre los años 2010 y 2011, en el que se incluyó un grupo de 356 pacientes con VIH/SIDA, de los cuales (249 varones y 107 mujeres), así como de un grupo de 472 controles (271 varones y 201 mujeres) donadores del banco de sangre del Hospital General de Culiacán. Todos los participantes de origen sinaloense, firmaron una carta de consentimiento informado. El comité de ética de dicho hospital aprobó el protocolo.

Los pacientes fueron informados de la naturaleza del estudio por el Dr. Elfego Abraham Leyva (elfegoleyvaa@hotmail.com) y la Dra. Gabriela Aldapa Leal (gueritaald@hotmail.com) de la Secretaría de Salud (tel. 1469124 y 1469009), a quienes los pacientes autorizaron la realización de estudios de laboratorio.

Determinación del genotipo Delta32 del gen CCR5, mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa.

De los individuos sujetos a investigación se tomaron 5 ml. de sangre periférica tomada por punción venosa, en un tubo lila con EDTA, el ADN genómico se obtuvo mediante el método CTAB-DTAB16 y posteriormente se verificó su calidad y su cantidad mediante espectrofotometría.

El segmento especifico del gen ccr5, localizado en la región cromosómica 3p21, se amplificó tal como lo describe Suresh P y cols, por Reacción en Cadena de la Polimerasa (del inglés: Polymerase Chain Reaction [PCR]) usando los siguientes iniciadores: CCR5-F: 5’-CTTGGCTGTCGTCCATGCTG-3’ y CCR5-R: 5’-CTGATCTAG AGCCATGTGCACAACTCT-3’17.

Las condiciones de RCP para el gen CCR5 fueron las siguientes:

200 mM de dNTPs, 1.5 mM de MgCl2, 0.6 mM de cada iniciador, 0.3 U Taq Pol y 60 ng DNA. La mezcla de reacción se sometió a 40 ciclos de amplificación a temperaturas de desnaturalización a 94 ºC durante 25 s, hibridación a 55 ºC durante 30 s. y de polimerización a 72 ºC durante 15 s. El amplicón de PCR de CCR5 fué de 703 o 735 pb para el alelo mutado o el alelo silvestre respectivamente, además para corroborar estos genotipos el amplicón fue digerido con 3 U de EcoRI a 37°C por 3 hrs, y los productos digeridos se corrieron por electroforesis en geles de poliacrilamida y tinción con nitrato de plata. Se obtuvieron bandas de 403 y 332 pb para el genotipo CCR5/CCR5 tipo silvestre, mientras que

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