Aplicaciones de las proteínas fluorescentes

[pic 1]Universidad Andrés Bello

Facultad de Ciencias Biológicas

Escuela de Bioquímica

Aplicaciones de las proteínas fluorescentes

Autores: Camila Andrea Chavarría Monje

               Mariajose Constanza López Pacheco  

Teléfono: 53228350

Correos: c.chavarramonje@uandresbello.edu

               m.12@uandresbello.edu

Introducción

La proteína verde fluorescente (GFP) revoluciono la biología celular de tal manera que a Osamu Shimomura quien descubrió esta proteína en 1968 mientras estudiaba la capacidad de emitir luz verde de la medusa Aequore victoria, también a Martin Chelfie el cual introdujo la proteína a un organismo completo y por ultimo a Roger Tsien quien fue capaz de crear nuevas proteínas fluorescente de diferentes colores se le otorgara el premio nobel de química en 2008.(1)

Las aplicaciones de las proteínas fluorescente son diversas como por ejemplo en estudio del cáncer, ver órganos internos, aplicaciones genéticas, también en plantas, en la visualización de moléculas de DNA, etc (2)

En esta última aplicación las proteínas fluorescente han sido de una gran utilidad ya que las moléculas de DNA se tiñen con colorantes orgánicos los cuales muchos de ellos son citotóxicos, pudiendo producir daños o mutaciones en el ADN. En cambio se creó dos proteínas fluorescentes que presenta dos pequeños péptido de unión al DNA (FP-DBP) , estas proteínas fluorescente pueden ser provenientes de la proteína verde fluorescente modificada (eGFP)  o de otra proteína fluorescente (mCherrry). Esta aplicación (FP-DBP) nos dan ventajas debido a que pueden ser ópticamente localizadas y así obtener un seguimiento celular además la unión de la PF-DBS al DNA es reversible frente a cambios de pH.

Hipótesis

La aplicación de las proteínas fluorescente mejora la visualización del ADN mediante la unión de dos péptidos de ella al ADN (FP-DBP), frente a tinciones de colorantes orgánicos.

Desarrollo  

Para el desarrollo de esta aplicación de visualización de la molécula de ADN se realizaron  diferentes procedimientos.

Entre ellos la construcción de proteínas, purificación y el crecimiento celular, a través de este procedimiento se obtuvo la proteína purificada y se diluyo para asi unirla al ADN y también se unió a este un colorante orgánico (YOYO-1)

También se realizó una preparación de la superficie del cristal, preparación microchhanel, absorción de fluorescencia/espectros de emisión, ensayo de cambio de movilidad electroforética, cámara de flujo, preparación de la superficie de proteínas y tinción reversible

La tinción del ADN con las proteínas fluorescente se realizan mediante la unión de dos pequeños péptido (KWKWKKA)   conectados a los terminales C y N de esta proteína fluorescente. Este diseño de unión se realizó sabiendo que las superficies recubiertas de neutravidina se unen moléculas de ADN de una manera reversible. La lisina y el triptófano forman un componente esencial para la inmovilización de las moléculas del ADN en la superficie de neutravidina. Los residuos de lisina cargados positivamente se unen mediante interacciones electrostáticas a la cadena principal del fosfato, las cuales están cargados negativamente. Los anillos aromáticos del triptófano se unen intercaladamente a las bases adyacentes en el ADN. Estas unión es reversible a un pH  mayor a 8.5, a causa de esto  nos muestra una descoloración del ADN, por ende hay control de unión y disociación de los péptido-FP (FP-DBPs)  mediado por el pH.

Para demostrar que la tinción era reversible a cambios de pH las moléculas de ADN se tiñen con FP-DBS a pH 8 y luego se lavaron a un pH 11 en el cual estaban sin la proteína fluorescente.

Se realizaron pruebas de secuencia de  KWKKA, (KW)2  KKA, y (KW)5 KKA vinculados a la eGFP en el N y C terminal, sabiéndose que para que esta unión sea comparable a los colorantes orgánicos (EtBr y YOYO-1). Se caracterizó varias variaciones de estos péptidos K5, KWK4, KWK3 WK y (KW)3 KK, en el cual tenían 5 residuos de lisina y un aumento de triptófano en cada uno. Observando que la presencia de un mayor número de residuo de triptófano conducen a una mayor asociación constante. A través de una  microscopía de epifluorescencia se observa que el  péptido KWKWKKA que muestra imágenes claras del ADN teñidas con la proteína fluorescente en que se utiliza una concentración de FP-DBP de 300nM pero la molécula de ADN puede ser proyectado hasta 50nM.

...