Apuntes de Electroforesis

Comparación de métodos de extracción de ADN en tejidos vegetales y animales por electroforesis en gel de agarosa.

Sandy Yulieth Ortiz tarazona; Oswaldo Parra Mayorga; Erika Hernandez

Muestras de estudio

Se analizaron dos tipos de tejidos, aquellos que incluían cinco muestras de origen vegetal en donde se manipularon fresas; las cuales se sometieron a una extracción de ADN por medio de técnicas con solventes orgánicos (método S) y aquellos que incluían 4 muestras de origen animal en las que se encontraban riñón, hígado, sangre (humana y de vacuno) y una muestra de origen vegetal en la que se utilizó nuevamente la fresa; las cuales se sometieron a una extracción de ADN por medio de la utilización de un kit comercial (método K). Todas la muestras se encontraban almacenadas en buffer TE a –20 °C.

Pureza y rendimiento del ADN

Es importante determinar la pureza y el rendimiento de la extracción de ADN mediante espectrofotometría donde se indica que la concentración de una molécula en solución depende de la cantidad de luz absorbida de las moléculas disueltas, donde el ADN absorbe la luz ultravioleta (UV) a 260 nm.  La pureza de la muestra se determina mediante la relación de las absorbancias a 260 nm y 280 nm.

• Cabe resaltar que en la implementación de esta práctica de laboratorio no se llevó a cabo este procedimiento.

Electroforesis del ADN

Las muestras obtenidas fueron comparadas por medio de electroforesis en gel de agarosa al 0,9% con solución amortiguadora de TBE (Tris borato-EDTA) teñido con bromuro de etidio, utilizando como marcador de peso molecular Lambda DNA/HindIII. La corrida de los ácidos nucleicos se realizó a 90 V durante aprox. 40 min. Posteriormente, el gel fue fotografiado bajo luz ultravioleta y la integridad del ADN extraído se determinó visualmente.

RESULTADOS

Patrón electroforético

La figura 1 muestra el patrón electroforético del ADN obtenido por los dos métodos de extracción. Se observaron grandes diferencias en las corridas electroforéticas entre los patrones de ADN a partir de los métodos S (Solventes orgánicos) y K (kit comercial), obteniéndose bandas en algunas muestras, mientras que en otras no. El ADN no se observó uniformemente teñido, con extensión hasta el fondo del corrido, lo que sugirió la presencia de degradación en algunas de las muestras.

 [pic 1][pic 2]

Figura 1.  Patron de electroforesis de las muestra de ADN en gel de agarosa 0,9% obtenidos por cada método de extracción. (1,2,3,4,5) numero de cada uno de los grupos de laboratorio. (S) Método de extracción porSolventes orgánicos. (K) Método de extracción por el Kit Comercial. (MP) Marcador de peso molecular. (RFP) (GFP) ADN plamídico.  

DISCUSION

Actualmente existen múltiples métodos de extracción de ADN para diversos tejidos; el método más frecuente utilizado es la extracción por fenol - cloroformo. El fundamento de este sistema de separación es la solubilidad de ácidos nucléicos, proteínas y lípidos con solventes orgánicos, pero tiene como inconvenientes la toxicidad del fenol, así como otros reactivos que contaminan fácilmente el ADN, por lo que se debe evitar acarrearlos en el proceso de purificación, al igual que procedimientos laboriosos, múltiples centrifugados y pipeteo que aumentan el riesgo de contaminación. Por otro lado, se utiliza la extracción con kit comercial que permite obtener un ADN de muy buena calidad, debido a que la columna permite capturar selectivamente al ADN haciendo posible obtener un extracto de alta pureza con moléculas íntegras; al tiempo que se reduce el número de pasos en la extracción y se disminuye la posibilidad de contaminación con ADN o ARN exógeno pero presenta como limitante principal el elevado costo.

Al comparar la integridad del ADN obtenida a partir de los dos métodos de extracción, en la electroforesis en gel de agarosa se observó que en el método de extracción por solventes orgánicos, se obtuvo precipitación de ADN pero a la hora de observar el patrón electroforético se presenció la degradación de este en algunos casos, en otros simplemente no es visible. Al comparar con el método de extracción por parte del kit comercial se evidencio que la calidad del ADN fue mejor ya que mostró algunas bandas íntegras, aunque en algunos casos se observan regiones donde el ADN está degrado.

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