BIOSÍNTESIS DE ANTIBIÓTICOS TRAVÉS DEL METABOLISMO DE LA CEPA ACTINOMYCETES MH-9 A TRAVÉS FERMENTACIÓN DE MATRAZ DE AGITACIÓN.

BIOSÍNTESIS DE ANTIBIÓTICOS TRAVÉS DEL METABOLISMO DE LA CEPA ACTINOMYCETES MH-9 A TRAVÉS FERMENTACIÓN DE MATRAZ DE AGITACIÓN.

Resumen

Una cepa de MH-9 (actinomicetos) se aisló a partir del suelo del desierto y manipulado para detectar su capacidad de producir los antibióticos. Optimización de los diferentes parámetros que refleja la producción de antibióticos era máxima a pH 7 y 37 ° C. La producción de antibiótico óptimo se obtuvo después de 120 - horas de incubación a 150 rpm. Actividad antibiótica se registró como ejemplo máximo de 38 mm frente a Bacillus subtilis, mientras que aumento de E. coli, Pseudomonas y Staphylococcus aureus zona de 30 y 31 mm se forma respectivamente. Extracción de la muestra con diferentes disolventes se llevó a cabo y el antibiótico que se sintetizó como resultado de las actividades metabólicas de MH-9 se encontró que era soluble en agua. El efecto de las proteínas de los antibióticos se observó por cromatografía en columna y observó la actividad en diferentes fracciones. La concentración de estreptomicina (4473μg/ml) y (228μg/ml) se determinaron en las fracciones y su posterior análisis fue confirmado por Espectrofotometro IR y el método TLC. Por otra parte también se comparó la actividad de mezcla de antibióticos en bruto con la estreptomicina y la kanamicina estándar. Actividad de antibióticos también se comprobó y se encontró mejor contra bacterias Gram positivas y se encontró buena contra bacterias Gram-negativas.

INTRODUCCIÓN

Los antibióticos son los agentes antimicrobianos, que son producidas por algunos microorganismos para inhibir o matar muchos otros microorganismos incluyendo diferentes bacterias, virus y células eucariotas. Se puede purificar a partir de la fermentación microbiana y modificada químicamente o enzimáticamente. Los antibióticos son metabolitos secundarios y estos metabolitos secundarios también se han llamado "idiolites" (Walker, 1974). El género más conocido de actinomicetos; Streptomycetes (orden Actinomycetales, Familia Streptomycetaceae) son grampositivas, bacterias filamentosas que son ubicuas en el suelo y producen la mayoría (> 70%) de los antibióticos conocidos. Hay una gran clase de antibióticos β-lactámicos producidas por bacterias, hongos y Streptomyces. Todos ellos poseen inusual unión química del núcleo β-lactámicos. En algún momento se muestra la "toxicidad selectiva", que significa que inhibe compuestos o mata a los microorganismos sin tener un efecto similar en el organismo huésped (por ejemplo, seres humanos). Más de 10.000 antibióticos se han aislado de la fermentación, materiales vegetales, tejidos animales y diversas fuentes marinas. Antibióticos de importancia comercial se utilizan en la agricultura, la medicina y la conservación de los alimentos. Más de 5000 antibióticos diferentes se han aislado a partir de cultivos de bacterias, hongos y células de plantas, 60% de ellos son aportados por género Streptomyces. Los antibióticos, como metabolitos secundarios, se producen generalmente por vías biosintéticas de varios pasos a partir de compuestos intermedios del metabolismo primario a restos específicos.

Los actinomicetos son bacterias gram-positivas aerobias que forman filamentos ramificados o hifas (generalmente 0.5-1.0μm) y esporas asexuales. Streptomycetes son mejor conocidos por su síntesis de una amplia gama de antibióticos, algunos de los cuales son útiles en la medicina y la investigación biológica. Los ejemplos incluyen anfotericina B, cloranfenicol, eritromicina, neomicina, nistatina, estreptomicina, tetraciclina y así sucesivamente. Aunque la mayoría de Streptomyces son saprofitos no patógenos, algunos están asociados con enfermedades de las plantas y animales. Se colocan en el orden de los Actinomycetales. Actinomicetos también se encuentran en el agua dulce, agua de mar, y los animales y compost de sangre fría y caliente. Actinomicetos producen más de 6,000 antibióticos químicamente diferentes de origen microbiano, y siguen siendo una excelente fuente de compuestos nuevos. Muchos de estos productos naturales son compuestos comercialmente importantes medicinales con una variedad de usos terapéuticos. La mayoría de los antibióticos y sustancias con diversa actividad biológica utilizado en la medicina son producidos por actinomicetos, sin embargo, otros microorganismos, tales como mixobacterias, Pseudomonas, Nocardias, Enterobacterias, Halobacterias, etc hypertermophiles se investigan para los nuevos metabolitos biológicamente activos por Behal (2003) . Como las bacterias del suelo pueden metabolizar una variedad de fuente de carbono y su actividad y regulación determinar sustancialmente el estado nutricional de la célula y, por lo tanto, influir en la producción de antibióticos.

MATERIALES Y METODOS

Actinomicetos cepa (MH-9) se usó como la fuente de la producción de antibióticos. La cepa se obtuvo en forma de pre-aislado en 02 de abril 2004 de Microbiología Laboratorio de Investigación, Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad Qaid-i-Azam, Islamabad. La identificación de los organismos de prueba se hizo sobre la base de pruebas morfológicas y bioquímicas estándar. Los cultivos de (MH-9) se almacenan a 4 ° C y actualizan periódicamente a los efectos del estudio. Optimización de los parámetros de crecimiento normal, como el nivel de pH, rango de temperatura, período de incubación, la optimización del tamaño del inóculo, se llevaron a cabo la optimización de los medios de comunicación. Sales medianas de glicerol Arginina (AGS) se utilizaron como medio de crecimiento para los actinomicetos. La capacidad de la cepa MH-9 para producir antibióticos se ensayó usando un medio de AGS por el ensayo de difusión en agar. Después de que mediante el uso de método de matraz de agitación de fermentación, 150 ml de medio de AGS se ajustó a pH 7 y 10% de inóculo se añadió en al medio. Los matraces se incubaron a 37 ° C en una incubadora de agitación. 10 ml de muestra se tomó después de cada intervalo de 24 horas. Las muestras se centrifugaron a 4 º C y 10.000 rpm (revolución / minuto) durante 30 minutos para obtener el sobrenadante libre de células. El sobrenadante se utilizó en el método de difusión en pocillo para comprobar la actividad antibiótica frente a bacterias, destacó prueba como positiva para la producción de antibióticos. Las bacterias se separaron del medio de fermentación mediante el uso de la técnica de centrifugación. El medio se centrifugó a 10.000 rpm durante 30 minutos a 4 ° C en una centrífuga Kokusan modelo H-251. El sobrenadante se filtró a través de papel de filtro Whatman n º 1, y se almacena en la cámara fría. Además, la precipitación de proteínas se llevó a cabo usando sulfato de amonio. 70 g de sulfato de amonio se añadieron a 100 ml de solución de antibiótico crudo a 4 ° C y la mezcla se agitó. Después de suficiente agitación, los precipitados se recogieron por centrifugación a 10.000 rpm y 4 ° C durante 30 minutos.

Ahora la filtración en gel utilizando Sephadex G-75 (70 cm x 2,5 cm) se utilizó para la separación de proteínas. El tampón utilizado fue 0,1 M KH2PO4.NaOH (pH 7) mientras que la solución de azul de dextrano se mantuvo a (0,5% W / V). La tasa de flujo se mantuvo a 5ml/15minutes. Cromatografía de capa fina (TLC) con etanol como fase móvil también se adoptó para la detección de proteínas. Después de la detección, las fracciones de la columna se compararon con las soluciones estándar de la estreptomicina y la kanamicina para detectar la presencia de estos antibióticos a través espectrofotómetro UV. Después de la purificación cromatográfica, muestras reunidas se concentraron por liofilización. El material liofilizado fue tratado con diferentes disolventes que incluyen acetonitrilo, etanol, acetona y cloroformo y la actividad antibiótica se probó a través de ensayo de difusión en agar.

Finalmente las muestras reunidas se concentraron por liofilización. El material liofilizado se ha ejecutado en espectrofotómetro de IR para el análisis del producto.

RESULTADOS Y DISCUSIONES

El presente estudio se llevó a cabo para manejar la producción de antibióticos de la cepa de MH-9, actinomicetos mesófilos. Los aislamientos se caracterizaron morfológicamente y se identificaron como Streptomyces sp. Los microorganismos se cultivaron en placas de Petri utilizando sales de glicerol de arginina medianas (AGS) como se sugiere por el-Nakeeb y Lechevalier (1963). Optimización de los parámetros siguientes para la producción de antibióticos de la cepa MH-en actinomicetos se ensayaron junto con la purificación del antibiótico y la separación de la proteína por cromatografía en columna en el presente estudio.

Nivel de PH

Se observó que a pH neutro (pH 7) la actividad antibiótica era máxima, mientras que a un pH de 6 y 8 se encontró ninguna actividad debido a las condiciones ácidas o alcalinas. Chattopadhyay y Sen (1997) mostraron la producción de antibióticos por Streptomyces máxima a pH 7 que está en la confirmación de los resultados celebrados como se destaca en la siguiente Tabla I. Para inducir una mayor cantidad de producción de antibiótico antifúngico de Strepytomyces rochei-G164 por la variación de Parmeters culturales han sido estudiados por Sen y Chattopadhyay (1997) y ha logrado máximo afectividad mientras sacarosa añadida como fuente de carbono y de peptona como fuente de nitrógeno a pH 7,0, que es el hallazgo de corte claro de nuestros datos celebrados.

Rango de temperatura

Durante la grabación de la temperatura a 28 ° C, 30 ° C, 37 ° C , 40 ° C y 47 °C, se observó que se observó

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