Bacterias Transformadas

Introducción

En este estudio, se aplicó un método para la regeneración y transformación de MB obtenidos de un cultivar italiano Ciliegiolo y dos de los portainjertos Vitis comúnmente utilizados, 110 Richter y Kober 5BB, en comparación con Thompson Seedless. Se utilizó la cepa EHA105 de A. tumefaciens, que alberga el vector binario pK7WG2, para los ensayos de transformación, que permitieron la selección a través de la proteína fuorescente de color verde mejorado (eGFP) y el gen de la neomicina fosfotransferasa (nptII). Los tejidos y / o brotes putativos transformados se identificaron mediante una selección basada en la expresión de eGFP sola o su uso en combinación con kanamicina en el medio.

Métodos

El material vegetativo se subcultivó cada 30 días en un medio que contenía sal MS y vitaminas 61, 3% de sacarosa, 4,4 µM de 6-bencilaminopurina (BAP) y 7 g L-1 planta de agar. Los explantes se mantuvieron en una cámara de crecimiento a 24 ± 1 ° C bajo un fotoperíodo de luz de 16 h (70 μmol m − 2 s−1) provisto por tubos fuorescentes blancos.

Para la inducción y el mantenimiento de MB se obtuvieron siguiendo protocolo as puntas de brotes derivadas de cultivos en proliferación se procesaron y se colocaron en el medio de iniciación (IM), con la adición de ácido 1-Naftalenacético (NAA) 0,01 µM. En cada subcultivo mensual (un total de 3), se eliminó la cúpula apical y se aumentó la concentración de BAP en el medio IM a diferentes concentraciones. Los MB obtenidos se mantuvieron y proliferaron cortándolos en medio de cultivo IM3 y se usaron como materiales de partida para los experimentos subsiguientes de regeneración y transformación. Los explantes se mantuvieron en una cámara de crecimiento a 24 ° C bajo un fotoperíodo de luz de 16 h (70 μmol m − 2 s − 1) provisto por tubos fuorescentes blancos.

Para las condiciones de transformación de Agrobacterium cepa y vid MB. Se inocularon cultivos bacterianos en medio YEB líquido (5 g L-1 de extracto de levadura, 1 g L-1 de peptona, 5 g L-1 sacarosa, 490 mg L-1 MgSO4, pH 7.2) que contenían 50 mg L-1 de rifampicina y 75 mg de L-1 de espectinomicina y se cultivaron a OD600 = 0.5–1.0 a una temperatura de 28 ° C en un agitador a 200 rpm. Las bacterias se sedimentaron y se resuspendieron en medio. Los MB de vid se cortaron en rodajas de 1 cm2 y 2 mm de espesor y sumergidos en la suspensión bacteriana durante 15 minutos, se secaron en papel flter y posteriormente transferido a medio sólido MSH0 (4.4 gL – 1 de sales MS, incluidas vitaminas, 3% de sacarosa, 0,7% de agar vegetal, pH 5.7). Las placas se incubaron durante 48 horas en condiciones de oscuridad a 24ºC. Para la eficiencia de regeneración y sensibilidad de los MB a la kanamicina. Se determinó el umbral de toxicidad de la kanamicina colocando rebanadas de MB no transformadas (1 cm2, 2 mm de espesor) de cada genotipo de vid en microbicidas (Micropoli, IT) que contienen medio IM3 suplementado con 300 mg de L-1 de cefotaxima. y kanamicina 0, 50, 70 y 100 mg L − 1. Los explantes se transfirieron a medios nuevos cada 3 semanas durante un total de tres subcultivos, cortando los nuevos brotes de regeneración en cada subcultivo para simular los tratamientos mecánicos que normalmente se aplican después de la infección por Agrobacterium. Se colocaron un total de 20 rebanadas de MB, divididas en cuatro repeticiones, en cada medio de selección. El experimento se repitió dos veces.

...