CENTRIFUGACION

Centrifugación

Introducción

Analizar una muestra de células sería muy dificultoso si no se contara con equipos necesarios para realizar dicho estudio, como por ejemplo, su tamaño no permite que esta sea observada a un nivel considerable sin el uso de un microscopio. También las metodologías cumplen una gran función puesto que nos entregan información para proceder en una investigación para luego realizar un alcance comparativo de los resultados obtenidos. La metodología de Centrifugación también nos permite el estudio de las células y consiste en la separación de macromoléculas biológicas, células y organelos, por diferencias de coeficientes de sedimentación, que a la vez permitiría la visualización de estos a través de la microscopía.

Si bien la célula está conformada por estructuras como los organelos este método nos permite el aislamiento de ellos, utilizando la técnica de Centrifugación diferencial, la cual consiste en romper las membranas celulares liberando el contenido celular, poner la mezcla homogenizada a distintas velocidades centrifugación y tiempo, de manera que el sedimento se separe del sobrenadante en cada centrifugación (aplicando al sobrenadante al menos 2 centrifugaciones sucesivas), obteniendo distintos organelos en cada fracción. Luego al pellet obtenido es llevado a una segunda técnica de centrifugación llamada en Gradiente de densidad que nos permitirá separar partículas y moléculas en base a sus distintas densidades utilizando una gradiente de sacarosa que permite separar desde la capa menos densa a la mas densa los distintos organelos en donde llegan a un punto donde la densidad de la gradiente es igual a la de la partícula.

A continuación se muestran las los porcentajes y densidades obtenidas luego de utilizar el método de Centrifugación, para determinar los organelos presentes en las células vegetales de hojas frescas de espinacas, al emplear centrifugación diferencial y Gradiente de densidad, obteniendo el porcentaje de sacarosa mediante un refractómetro y posterior comparación de los datos obtenidos definiendo la existencia de cada estructura.

Materiales

• Hojas frescas de espinaca

• Soluciones de sacarosa : 33%, 44%, 50%, 57%, 60% (w/v)

• Solución homogenizante: 0.4M Sacarosa; 0.165M Tris-HCl buffer, pH 7.5; 0.01M KCl

• Soluciones de sucrosa:

1.5 ml de sucrosa 60 %

3.0 ml de sucrosa 57 %

4.5 ml de sucrosa 50 %

4.5 ml de sucrosa 44 %

1.5 ml de sucrosa 33 %

• Mortero

• Gasa para filtrar

• Centrifuga Sigma

• Ultracentrífuga Beckman

• Refractómetro

• Embudo

• Soporte

• Tubos de ensayos

• Tubos de centrifuga

• Vortex

• Pipeta aforada

• Tubos Eppendorf

• Micropipeta

Procedimientos

1- Cortar en trozos pequeños las hojas de espinacas sin nervaduras y pesar 15 g de estas, molerlas en el mortero agregando de a poco 40 ml de medio homogenizante frio, una vez conseguida una pulpa filtrar a través de la gasa y transferir 15 ml del filtrado a los tubos de centrifuga y centrifugar a 4° C por 5 minutos a 800 r/min.

2- Retirar el sobrenadante de la primera centrifugación en 2 tubos d centrifuga limpios y frios y volver a centrifugar a 4° C por 10 minutos a 12.000 g en centrifuga Sigma

3- Preparar 2 tubos de centrifuga para la gradiente de sacarosa. Se deben colocar en orden y muy lentamente las siguientes soluciones escurriendo por el tubo

1.5 ml de sucrosa 60 %

3.0 ml de sucrosa 57 %

4.5 ml de sucrosa 50 %

4.5 ml de sucrosa 44 %

1.5 ml de sucrosa 33 %

4- Se retira y guarda el sobrenadante de la segunda centrifugación y se resuspende el pellet en 1 ml de medio homogenizante. Colocar lentamente 1ml de pellet suspendido sobre la gradiente de sacarosa. Balancear el peso de los tubos de centrifuga (tiene que ser el mismo peso para ambos tubos) agregando pellet suspendido.

5- Centrifugar los tubos a 4° C por 1 hora a 25.00 rpm en la ultracentrífuga Beckman.

6- Luego de transcurrida la centrifugación, observar las zonas formadas y fraccionar el contenido del tubo tomando 1,0 ml y colocándolos en tubos eppendorf.

7- Determinar el % de sacarosa en cada fracción mediante un refractómetro y utilizar las tablas 1 y 2 de la guía para saber la densidad y en que fracción es posible encontrar diferentes organelos.

Resultados

Lectura de °Brix:

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