COMPORTAMIENTO BIOQUÍMICO DE DIFERENTES MICROORGANISMOS.

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Practica 14:

COMPORTAMIENTO BIOQUÍMICO DE DIFERENTES MICROORGANISMOS

3°I3

EQUIPO 1:

ANDREA ITZEL MIRAMONTES JAIME

EDITH PAULINA CORONA RAMÍREZ

JOSÉ MANUEL VEGA GASTELUM

DULCE JAZMÍN ARREOLA LÓPEZ

Objetivos:

1. Conocer los procedimientos generales para la identificación de microorganismos mediante el comportamiento bioquímico.
2. Reforzar los conocimientos adquiridos durante el curso para la diferenciación microscópica de los microorganismos.
3. Aplicara los conocimientos teóricos para la interpretación de pruebas bioquímicas.
4. Conocerá las técnicas aplicadas para la determinación de catalasa, coagulasa, oxidasa e IMVIC.

Introducción:

En los laboratorios de las industrias, son examinadas rutinariamente muestras de agua, alimentos y diversos productos industriales para la búsqueda de microorganismos contaminantes y patógenos. Una vez aislados, estos microorganismos son sometidos a pruebas para su identificación y clasificación.                                                                                      Los microorganismos deben ser separados e identificados por varias razones:

1. Determinación de los patógenos responsables de enfermedades infecciosas.
2. Selección y aislamiento de cepas fermentadoras para uso industrial, en la producción de alcoholes, bebidas, alimento, hormonas, antibióticos, aditivos, vitaminas y solventes.
3. Para comparar actividades bioquímicas con fines taxonómicos.

Material por grupo:

• TSI
• LIA
• Agar citrato
• MIO                                                                                                                                                                                          
• Caldo RM-VP                                                                                                                                    
• Caldo urea                                                                                                                            
• Gelatina nutritiva                                                                                                                        
• Caldo nitrato                                                                                                                        
• Gelosa almidón                                                                                                                                                                                                              
• Agar tributirina                                                                                                                  
• Colorantes para tinción al Gram                                                                                                                        
• H2O2 (agua oxigenada)                                                                                                                  
• Reactivo de Kovac                                                                                                                                    
• Rojo de metilo                                                                                                                                          
• Alfa naftol                                                                                                                                          
• Hidróxido de potasio al 40%
• AST
• EMB
• Papel estrasa
• Auto clave
• Base de auto clave

Material por equipo:

• 4 pipetas Pasteur
• 1 piseta con agua
• Tres matraz erlenmeyer de 250 ml
• 1 espatula
• 1 placa de calentamiento con agitación
• Agitador magnético
• 3 vasos de precipitados de 100 ml
• 1 probeta de 100 ml
• Balanza granataria
• 16 tubos con rosca
• 4 cajas Petri
• Mechero Fisher
• Asa recta
• Asa bacteriológica
• 2 pipetas de 1 ml
• 4 vamos de precipitados de 250 ml
• Papel para limpieza de lentes
• Microscopio                                                                                                                                              
• Aceite de inmersión
• 2 portaobjetos                                                                                                                                      
• Cepa de estudio

Procedimiento:

Nota: Toda esta técnica se realiza frente a un mechero para crear un área estéril.

• Inocular los medios de cultivo con la cepa de su interés para el estudio bioquímico y la identificación del género de la bacteria.
• Incubar todos los tubos inoculados a una temperatura de 35 +/- 2aC por 18 a 24 horas.
• Realizar las pruebas conforme se describen enseguida y anotar sus resultados y conclusiones.

1. Prueba del citrato sódico

• La reacción es positiva si el crecimiento es visible, si la bacteria utiliza el citrato cambia de color verde a azul.

1. Prueba de Indol

• Añadir 0.2 ml de reactivo de Kovac al tubo que contiene el medio de cultivo de SIM, y agitar.
• Si aparece un color rojo en la superficie de la capa de alcohol amílico, la prueba es positiva.

1. Prueba de rojo de metilo

• Del caldo RM-VP separar la mitad en un tubo de ensayo limpio, agregar a un tubo de ensayo unas 4 gotas de indicador rojo de metilo.
• La prueba es positiva si hay aparición de un color rojo permanente.

1. Prueba de Voges-Proskauer

• Adicionar al segundo tubo del medio de cultivo RM-VP 6 gotas de alfa-naftol, 2 gotas de KOH al 40% y unos cristales de creatinina.
• Dejar reposar sin tapar durante 2 horas a temperatura ambiente.
• La aparición de un anillo color rojo en la superficie del medio revela la presencia de acetil metil carbinol.

1. Agar TSI

• Coloración amarilla (reacción acida) del medio en la parte inclinada como en el fondo del tubo nos demuestra que el microorganismo fermenta tanto la glucosa como alguno de los disacáridos presentes en la muestra.
• Si la coloración amarilla (reacción acida) solo se presenta en el fondo del tubo indica que el microorganismo fermento únicamente la glucosa pero no lo hacen con ninguno de los disacáridos (lactosa ni sacarosa).

1. Agar LIA

• Si se presenta color purpura en todo el medio (reacción alcalino) descarboxilan la lisina con formación de aminas. Los microorganismos que no descarboxilan la lisina pero que fermentan la glucosa, producirán un color amarillo en el fondo (reacción acida), aunque puede presentarse en el medio completo.
• Los cultivos que tienen la capacidad de producir ácido sulfhídrico provocan ennegrecimiento en el fondo del tubo, tanto en este medio como en el de TSI.

1. Prueba de producción de ureasa.

• Realizar la prueba en caldo urea, si la prueba es positiva presenta una coloración rosa intensa, comparar frente a un testigo.
• La reacción es alcalina por la producción de amoniaco en el medio.

1. Prueba de catalasa.

• Tomar un inoculo del microorganismo y colocarlo en un portaobjetos.
• Agregar 2 gotas de agua oxigenada y observar si hay formación de burbujas o espuma, producto de la hidrolisis del agua oxigenada.

1. Prueba de la oxidasa.

• Tomar una colonia del microorganismo y colocarlo en un portaobjetos.
• Agregar 2 gotas de la solución de dihidrocloruro de tetrametil parafenilendiamina.
• La prueba es positiva si existe cambio de coloración desde rosa a marrón hasta llegar a color negro.

1.  Hidrolisis del almidón

• Realizar la prueba en el medio de gelosa almidón.
• Inundar la caja de gelosa almidón con yodo de Gram, dejar por 30 segundos y eliminar el exceso.
• Examinar la presencia o ausencia de un halo claro alrededor de la biomasa desarrollada.

1. Hidrolisis de la gelatina.

• Realizar la prueba en agar gelatina.
• Colocar los tubos en refrigeración a 4aC por 30 minutos, examinar los tubos y determinar si el medio esta solido o líquido.
• Positivo si el medio es líquido hay licuefacción de la gelatina.

Resultados:

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