Cadenas Respiratorias

Practica No. 1 Transporte de Glucosa en Levaduras.

Hipótesis:

Si el transporte de glucosa en Saccharomyces cerevisiae es llevado a cabo por un transporte pasivo, entonces, la adición del N-etil-maleimida (NEM) afectará la estructura de la proteína transportadora inhibiendo su función; por lo tanto, el transporte de glucosa se verá afectado imposibilitando la interiorización de la glucosa a través de dichos mediadores.

Diseño Experimental:

a) Lavamos las células para eliminar el contenido de restos de fuentes de carbono que pudieran aprovechar las células para integrarlas a su metabolismo y así minimizar los errores, con esto, queremos obtener el paquete celular de levaduras.

b) Con el matraz 1 pretendemos demostrar el efecto que tiene la temperatura (4° C) sobre la captación de glucosa. Es por eso que el matraz con la mezcla se debe mantener en un baño de hielo;

En el matraz 2 tenemos un testigo positivo, el cual estará a temperatura ambiente para comprobar que las células estén en buen estado y que puedan ser viables para captar glucosa; es por ello que los inhibidores se pre incuban a temperatura ambiente para evitar que el frio de éstos, afecte a la membrana celular.

En el matraz 3 agregamos el inhibidor DNF, el cual nos dirá si el transporte es activo o pasivo, ya que éste desacopla la cadena de transporte de electrones de la fosforilación oxidativa e inhibe la producción de ATP [1].

En el matraz 4, agregamos NEM para demostrar que el transporte es de tipo mediado o no mediado, al ser un agente alquilante de los grupos sulfhidrilo, la N-etil maleimida, se une a las proteínas de la membrana y cambia su conformación, lo que hace que la glucosa no pueda entrar a la célula[2].

El matraz 5 es nuestro testigo negativo, el cuál no posee glucosa, si se observara lectura en el espectrofotómetro, esto nos indica que las células no se lavaron bien, y por lo tanto en los resultados anteriores tenemos errores.

Luego de tomar alícuotas de 2 mL de cada tubo a los tiempos 0, 10, 20 y 30 minutos, recibimos en tubos con NaOH, el cual nos sirve para detener la reacción, ya que al modificar el pH, precipita las proteínas y el transporte ya no se sigue llevando a cabo.

Centrifugamos para eliminar los restos celulares, las proteínas precipitadas, y lo único que queremos es el sobrenadante donde está la glucosa residual, la que no fue aprovechada e incorporada por la levadura.

c) la alícuota anterior la llevamos a 1 mL con agua destilada (diluimos para que entre dentro de la curva de calibración), añadimos DNS (3, 5-dinitrosalicilico) para determinar azúcares reductores, esto se lleva a cabo debido a que éste reactivo de color amarillo, se reduce, oxidando a la glucosa y el resultado es (3-nitro, 5-aminosalicilato) de color rojo debido a que fue reducido. Luego calentamos a baño maría por 10 minutos, agregamos 2 mL de agua destilada para que sea volumen suficiente para que el espectrofotómetro pueda leerlo. Lo que cuantificamos fue el azúcar que no fue incorporado y gracias a esto podemos obtener la cantidad de azúcar (glucosa) consumida por la célula, esto se leyó a 540 nm.

Objetivos:

Genérales.-

Determinar el tipo de transporte que utiliza la levadura Saccharomyces cerevisiae para incorporar glucosa.

Específicos.-

Determinar si Saccharomyces cerevisiae lleva a cabo un transporte mediado o no mediado mediante el uso de inhibidores como el NEM

Determinar si Saccharomyces cerevisiae lleva a cabo un transporte activo o pasivo mediante el uso del DNF

Determinar el efecto de la temperatura en el transporte de glucosa

Registro de Datos:

Tabla 1. Curva tipo de Glucosa.

μg de Glucosa Absorbencia (540 nm)

0 0

100 0.198

200 0.560

300 0.715

400 0.910

500 1.111

Tabla 2. Determinación de Glucosa Residual.

Absorbencia (540 nm)

Matraz No. 0 min. 10 min. 20 min. 30 min.

1 0.879 0.837 0.843 0.812

2 0.943 0.511 0.091 0.017

3 0.646 0.834 0.315 0.098

4 0.010 0.005 0.009 0.012

5 0.014 0.009 0.012 0.014

Los valores anteriores se obtuvieron leyendo contra el tubo no. 1 de la Curva tipo (blanco de reactivos)

Manejo de Datos:

Grafico 1. Curva tipo de Glucosa

Ejemplo de Cálculos:

Utilizando las siguientes formulas calculamos la concentración, Glucosa residual y Glucosa consumida.

x=(Y-a)/b= µg/ml Concentración de Glucosa

Glucosa residual=concentracion mg/ml x 1/(0.3)=mg/ml

Glucosa consimida=Glucosa inicial-Glucosa residual=mg/ml

Tomando en cuenta la Ecuación de la Recta tenemos

Concentracion=(A-0.0219)/(0.00224)

Para el Matraz No. 1

0 min.(0.879-0.0219)/(0.00224)=382.63

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