Cinética

Medición de la cinética enzimática usando un sistema de microfluidos con flujo continuo

Este documento describe un método micro analítico para determinar la cinética enzimática usando un sistema de microfluidos con flujo continuo. El análisis se lleva a cabo mediante la inmovilización de enzimas por medio microperlas, en el que la enzima es embebida dentro de un micro reactor a base de chips (volumen -1.0 nL) y en donde el sustrato fluye por encima. Los datos se analizaron usando la ecuación de Lilly-Hornby y se compararon con los valores obtenidos mediante mediciones convencionales basadas en la ecuación de Michaelis-Menten. Las dos reacciones catalíticas de las enzimas que se estudiaron fueron elegidas de modo que el sustrato no fuera fluorescente y el producto sí. La primera reacción involucró la reacción catalizada por peroxidasa de rábano entre el peróxido de hidrógeno y el N-acetil-3,7 dihidroxifenoxazina para crear resorufina fluorescente, y la segunda involucró la reacción catalizada por beta galactosidasa de resurfina no fluorescente β-Dgalactopiranósido para obtener D-galactosa y resurfina fluorescente. En ambos casos el método basado en microfluidos arrojó los mismos resultados que los que se obtuvieron por el método tradicional de Michaelis-Menten. El método de flujo continuo requirió alrededor de 10 µL de solución de sustrato y 〖10〗^9 de moléculas. Este enfoque proporciona un nuevo medio para la rápida determinación de la cinética enzimática en los sistemas de microfluidos, que puede ser usado para diagnósticos clínicos, descubrimiento de medicinas y análisis.

Los dispositivos a base de chips para microfluidos han sido desarrollados para un gran número de ensayos y pruebas, incluyendo el análisis de ADN, análisis de proteínas e inmuno ensayos. Durante la última década fue demostrado que, comparado a los instrumentos analíticos tradicionales, la plataforma de microfluidos proporciona un medio para reducir el tiempo de análisis y la cantidad de reactivo necesario para llevar a cabo cada análisis. Sin embargo, la comercialización rentable de los sistemas microanalíticos espera por el desarrollo de métodos capaces de capitalizar estas ventajas sin causar problemas que se sobrepongan a estas. Se destaca la necesidad de describir un método analítico para medir la cinética enzimática usando un sistema de flujo continuo de microfluidos. En este enfoque, un canal de microfluidos es llenado con perlas modificadas de enzimas, y después un sustrato no fluorescente se mueve sobre el lecho de perlas por el flujo de convección. Es posible relacionar la tasa de reacción con la apariencia producto fluorescente de la reacción catalizadora.

El primer informe que se tiene sobre el uso de un sistema de microfluidos para el análisis cinético de una reacción enzimática fue proporcionado por Hadd et al, quien uso el transporte electrocinético controlado por computadora para diluir y mezclar reactivos. Específicamente, concentraciones preciosas de sustrato fluorogénico fueron mezcladas con β-galactosidasa y la cinética de la reacción fue obtenida mediante el monitoreo de la fluorescencia de la hidrólisis del producto. Recientemente, Duffy desarrolló un sistema centrífugo para microfluidos capaz de llevar a cabo múltiples, simultáneos y homogéneos ensayos de detección colorimétrica.

La mayoría de los informes cuantitativos anteriores de actividad enzimática midieron el uso de sistemas de microfluidos y se llevaron a cabo en soluciones homogéneas. Sin embargo, ensayos heterogéneos usando enzimas inmovilizadas tienen el potencial de proveer las siguientes ventajas: facilidad para distribuir las enzimas en las matrices, capacidad de análisis de las proteínas de membrana (no es posible en soluciones homogéneas), simplificación del reciclaje de la enzima, análisis de flujo continuo. Como se discutirá posteriormente, un inconveniente potencial de este enfoque es que la inmovilización de enzimas puede alterar sus tasas cinéticas intrínsecas.

Curiosamente, solo unos pocos informes describen el uso de bio-moléculas inmovilizadas ya sea directamente en las paredes de microcanales o sobre un soporte contenido dentro del canal. Por ejemplo, un informe muy antiguo de Karube y sus compañeros de trabajo describieron un sensor para la detección de glucosa basado en la inmovilización de la oxidasa de la glucosa en las paredes de capilares micromaquinados.

Más recientemente, Harrison, presentó que un dispositivo de microfluidos que contiene tripsina inmovilizada sobre perlas se podría utilizar para digerir proteínas antes del análisis de la espectrometría de masa. Mao sugirió un método para inmovilizar enzimas en bicapas de fluidos apoyados en las paredes de los canales de microfluidos y posteriormente evaluar su cinética en una sola toma usando un control laminar del flujo de dilución. Finalmente, Peterson sugirió la preparación de monolitos porosos reactivos dentro de los microcanales, su uso como soportes para la inmovilización de tripsina y la caracterización de los conjugados resultantes de la digestión de proteínas.

En párrafos anteriores, se describió un sistema centrífugo para microfluidos capaz de llevar a cabo múltiples, simultáneos y homogéneos ensayos de detección colorimétrica y análisis de hibridación de ADN. Un hallazgo clave de estos estudios es que las microperlas ofrecen la conveniencia de manipulación de fluidos, un alto grado de flexibilidad y caracterización sintética, un ratio muy alto superficie a volumen en comparación a dispositivos de canal abierto de microfluidos, y la capacidad para mezclar eficientemente los reactivos bajo condiciones de flujo laminar.

Las cinéticas intrínsecas de enzimas solubles en soluciones homogéneas se describen generalmente por la relación de Michaelis-Menten. Sin embargo, la cinética de las enzimas inmovilizadas puede ser diferente de aquellas medidas para la misma enzima en una solución debido a las restricciones de difusión o a las interacciones con el soporte.

La cinética de los biocatalizadores inmovilizados se denomina a menudo como “cinética aparente”. En condiciones estables, la cinética aparente en reactores enzimáticos de microperlas se calcula usando un formalismo que se conoce como el modelo de Lilly-Hornby. En los experimentos que aquí se reportan, la peroxisidasa de rábano (HRP) fue inmovilizada en microperlas a través de la conjugación de estreptavidina-biotina, y la cinética de la reacción catalizada de peroxisidasa de rábano entre el peróxido de hidrógeno y el N-acetil-3, 7-dihidroxifenoxazina fue monitoreada en condiciones de flujo continuo. Los resultados se comparan favorablemente a los valores proporcionados por la literatura y con los valores obtenidos

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