Citometría De Flujo

Citometría De Flujo

La citometría de flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparametrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células) alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado. La citometría de flujo es una tecnología (proceso) que permite la medida simultánea de múltiples características físicas de una sola célula. Estas medidas son realizadas mientras las células (partículas) pasan en fila, a una velocidad de 500 a 4000 células por segundo, a través del aparato de medida en una corriente de fluido (1).

EL CITOMETRO NECESITA UN SISTEMA COMBINADO DE :

• Fluidos, para introducir y restringir las células para análisis

• Optica , una fuente de excitación y un sistema colección para generar y recoger las señales luminosas. El sistema de excitación consiste en un láser, lentes y prismas para dirigir el rayo. El sistema de colección consiste en espejos ópticos y filtros para encaminar determinadas longitudes de onda hacia detectores ópticos determinados.

• Electrónica, para convertir las señales ópticas en señales electrónicas proporcionales y digitalizarlas para análisis computacional.

SISTEMA HIDRAULICO: Controles neumático y fluidos para establecer un flujo laminar que permita a la suspensión celular atravesar la cámara de flujo.

SISTEMA OPTICO: Láser (Argón con luz monocromática de 488nm , filtros , lentes y detectores.

SISTEMA ELECTROINFORMATICO: Convierte la luz dispersa en señales eléctricas y las procesa para su análisis.

Sistema optico

El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la célula y que son recogidos por distintos detectores.

PARAMETROS

Características Morfológicas de la célula: tamaño y complejidad del citoplasma

Características antigenicas de la célula : Inmunofenotipo.

En el estudio de la EMR se utiliza para analizar una muestra de células y cuantificar cuántas células malignas están presentes en esa suspensión de células. Las muestras utilizadas pueden ser tanto sangre como aspirados de médula ósea. Las células son marcadas con distintos anticuerpos específicos para distintos antígenos conocidos que son expresados específicamente por las células tumorales. Los antígenos empleados para estos fines son proteínas de membrana o intracitoplasmáticas. Los anticuerpos son marcados con distintos fluorocromos. Así, el citómetro de flujo puede detectar y clasificar las distintas células de la muestra y cuantificarlas mediante un sistema informático apropiado.

Esta tecnología se emplea para analizar y definir el perfil inmunofenotípico de las células neoplásicas y así poder establecer la presencia de fenotipos aberrantes.

Su principal aplicación oncológica es la evaluación y seguimiento de leucemias agudas, leucemias linfoblástica crónicas y otros síndromes linfoproliferativos con infiltración medular o expresión en sangre periférica. Tiene una sensibilidad de 10-4 a 10-5, es decir, detecta una célula tumoral de entre 10.000 y 100.000 células normales (Tomás et al., 2004).

En la evaluación de la EMR de las patologías oncohematológicas es útil la determinación de fenotipos propios de la población leucémica, su presencia en la recidiva y la presencia de fenotipos aberrantes. Las células leucémicas, salvo raras ocasiones, no tienen antígenos específicos que nos permitan distinguirlas de las células normales. Sin embargo, sí expresan fenotipos que están escasamente representados en personas sanas o son indetectables en las células normales.

REACTIVOS FLUORESCENTES

• Marcadores fluorescentes de unión covalente: Isoticianato de Fluoresceina, Picoeritrina, rodamina, rojo texas, cianinas.

• Marcadores fluorescentes de unión no covalente: Hoechst, DAPI, Naranja de acrimina, yoduro de propidio, rh12.

Los marcadores fluorescentes son sensibles al medio ambiente.

Pequeñas moléculas orgánicas (FITC, biotina): unión covalente directa con grupos amino libres en anticuerpos

Proteínas fluorescentes (ficoeritrina, aloficocianina): se unen a anticuerpos a través de algunos reactivos.

REALIZACIÓN DE CITOMETRIA DE FLUJO

Se hace en 3 etapas independientes:

• Fase pre-citometría: preparación de los reactivos, preparación de las células, diseño del protocolo y coloración de las células con los reactivos fluorescentes.

• Fase de citometría de flujo: involucra el procesamiento de las células marcadas y la recolección de los datos para cada una de las medidas (parámetros) realizados en cada célula individual.

• Fase de análisis: análisis de los datos recolectados

La mezcla de células teñidas con diferentes fluorocromos es forzada a pasar a través de una aguja creando una delgada fila de líquido que contiene las células. A medida que cada célula pasa en frente del láser, desvía el rayo incidente y las moléculas teñidas unidas a la célula van a ser excitadas y emiten luz fluorescente. Tubos fotomultiplicadores detectan tanto la luz desviada y las emisiones fluorescentes, la información es digitalizada y procesada por el computador. Los resultados son presentados a manera de histogramas o "dot-plots".

APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

• Hematología : tipificacion y conteo de células , reticulocitos y análisis de medula ósea

...