Citrometria De Flujo

Citometria de Flujo

La citometria de flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparametrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células) alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado. La citometría de flujo es una tecnología (proceso) que permite la medida simultánea de múltiples características físicas de una sola célula. Estas medidas son realizadas mientras las células (partículas) pasan en fila, a una velocidad de 500 a 4000 células por segundo, a través del aparato de medida en una corriente de fluido.

EL CITOMETRO NECESITA UN SISTEMA COMBINADO DE :

• Fluidos, para introducir y restringir las células para análisis

• Optica , una fuente de excitación y un sistema colección para generar y recoger las señales luminosas. El sistema de excitación consiste en un láser, lentes y prismas para dirigir el rayo. El sistema de colección consiste en espejos ópticos y filtros para encaminar determinadas longitudes de onda hacia detectores ópticos determinados.

• Electrónica, para convertir las señales ópticas en señales electrónicas proporcionales y digitalizarlas para análisis computacional.

SISTEMA HIDRAULICO: Controles neumático y fluidos para establecer un flujo laminar que permita a la suspensión celular atravesar la cámara de flujo.

SISTEMA OPTICO: Láser (Argón con luz monocromática de 488nm), filtros, lentes y detectores.

SISTEMA ELECTROINFORMATICO: Convierte la luz dispersa en señales eléctricas y las procesa para su análisis.

Sistema optico

El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la célula y que son recogidos por distintos detectores.

PARAMETROS

Características Morfológicas de la célula: tamaño y complejidad del citoplasma

Características antigenicas de la célula: Inmunofenotipo.

PARAMETROS FISICOS

• Su tamaño relativo (forward scatter-FSC)

• Su granularidad relativa o complejidad interna ( side scatter SSC).

FLUORESCENCIA RELATIVA (FL1, FL2, FL3)

• Determinación cuantitativa de características antigénicas, bioquímicas y biofísicas de células individuales (1,2).

OBJETIVOS PRINCIPALES DE

LA CITOMETRIA DE FLUJO

• Identificar y enumerar subpoblaciones celulares únicas y definidas.

• Seleccionar y separar físicamente subpoblaciones de células deseadas (por deflección electrostática ; esta tecnología de separación se llama "electronic cell sorting")

• Medir capacidad funcional de subpoblaciones celulares definidas

COMO SE DETECTAN ESTAS CARACTERISTICAS

El citómetro de flujo detecta como las células interactúan con un rayo láser en términos de cómo la célula :

• desvía la luz incidente (parámetros FSC y SSC)

• emite fluorescencia (parámetros FL1. FL2. FL3).

LAS PROPIEDADES DE DISPERSION DE LA LUZ UNA CELULA NOS DA INFORMACION ACERCA DEL TAMAÑO CELULAR Y GRANULARIDAD

SEÑALES DE DISPERSION

Forward Scatter (FS) :luz dispersada frontalmente en ángulo cónico pequeño (0-10 grados ) coincidente con luz incidente y es proporcional a tamaño de la partícula que produce la dispersión.

• La luz es desviada a bajos ángulos entre 1 y 10 grados

• Generalmente proporcional al tamaño celular

• Detectada a lo largo del eje del rayo de luz incidente en dirección delantera

Side Scatter (SSC) : luz dispersada lateralmente es proporcional al la complejidad de la estructura celular.

• Luz es desviada a altos ángulos

• Proporcional a la granularidad de la célula y su complejidad

• Detectado a 90 grados del eje de luz incidente.

FLUORESCENCIA

Un fluorocromo es una molécula química que absorbe la luz a una determinada longitud de onda o energía de excitación y emite a una longitud superior (MENOR ENERGIA)

Interacciona con la luz de excitación procedente de el láser. Se utiliza unido a anticuerpos específicos (monoclonales) para antígenos de la célula. La cantidad de fluorescencia con la cual una célula se tiñe es proporcional a la cantidad de sitios de unión.

Cómo se obtiene la luz fluorescente.

• Unión de sitios específicos con anticuerpos marcados con fluorocromos

• El fluorocromo absorbe energía del láser

• El fluorocromo libera energía absorbida por :

• Vibración y disipación del calor.

• Emisión de fotones a una mayor longitud de onda llamada fluorescencia.

REACTIVOS FLUORESCENTES

Marcadores fluorescentes de unión covalente: Isoticianato de Fluoresceina, Picoeritrina, rodamina, rojo texas, cianinas.

Marcadores fluorescentes de unión no covalente: Hoechst, DAPI, Naranja de acrimina, yoduro de propidio, rh12.

Los marcadores fluorescentes son sensibles al medio ambiente.

• Pequeñas moléculas orgánicas (FITC, biotina): unión covalente directa con grupos amino libres en anticuerpos

• Proteínas fluorescentes (ficoeritrina, aloficocianina): se unen a anticuerpos a través de algunos reactivos.

REALIZACIÓN DE CITOMETRIA DE FLUJO

Se hace en 3 etapas independientes :

• Fase pre-citometría: preparación de los reactivos, preparación de las células, diseño del protocolo y coloración de las células con los reactivos fluorescentes.

• Fase de citometría de flujo : involucra el procesamiento de las células marcadas y la recolección de los

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