Componentes De La PCR

Componentes de PCR

H2O
Mg (MgCl2)
Buffer 10x
dNTP’s
primers (forward, reverse) oligonucleotidos o iniciadores
taq pol
DNA templado

Fundamento

La reaccón de la polimerizacion se caracteriza por llevarse a cabo a altas temperaturas soportadas por la enzima taq-polimerasa(72°C)

A partir de una sola copia de DNA genómico se amplifica e forma exponencial una secuencia especifia de nucleótidos que esta delimitada por 2 iniciadores o primers que flanquean la región 3’ de ambas hebras del DNA.

La secuencia de DNA amplificada es visualizada en un gel de agarosa, de donde puede ser purificada en suficiente cantidad (ng) y manipulada para los fines necesarios del investigador

3 etapas:

Desnaturalización: La reacción se calienta a altas temperaturas para reducir la doble hélice del ADN a cadenas simples. Estas cadenas se tornan accesibles a los cebadores

Hibridación: Se enfría la mezcla de reacción. Los cebadores hibridan con las regiones complementarias de las cadenas del ADN patrón, y se forman nuevamente cadenas dobles entre los cebadores y las secuencias complementarias

Extensión: La Taq polimerasa sintetiza una cadena complementaria. El enzima lee la secuencia de la cadena opuesta y extiende los cebadores agregando nucleótidos en el orden en que pueden emparejarse. El proceso entero se repite una y otra vez
http://www.bioversityinternational.org/fileadmin/bioversity/documents/publications/Molecular_Markers_Volume_1_es/III_3_PCR.pdf

http://www.biovac.cl/PDF/Fundamentos%20de%20PCR%20(Horst%20Grothusen).pdf buenas imagenes :B

3 ciclos:

El ciclo 1 es como sigue:

• Durante la desnaturalización (cerca de 1 min a 95°C), las cadenas del ADN se separan para formar cadenas sencillas.

• Durante la hibridación (cerca de 1 min a temperaturas que oscilan entre 45°C y 60°C), un cebador se une a una cadena de ADN y otro se une a la cadena complementaria. Los sitios de hibridación de los cebadores se han elegido para que fomenten la síntesis del ADN en la región de interés durante la extensión.

• Durante la extensión (cerca de 1 min a 72°C), la síntesis del ADN se lleva a cabo en la región de interés y con distancias variables en la región flanqueante, produciendo fragmentos de longitudes variables.

Cuando comienza el segundo ciclo, hay en realidad dos tipos de patrón: (1) las cadenas del ADN original; y (2) las cadenas del ADN recién sintetizadas, que constan de la región de interés y de fragmentos de longitud variable de la región flanqueante, en el extremo 3’. Cuando se usa este último patrón en este ciclo, solamente se copia la región de interés.

En el tercer ciclo, la región de interés recién sintetizada (es decir, sin regiones flanqueantes) actúa como patrón. La molécula de ADN original está todavía presente y lo

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