Cromatografia

OBJETIVO:

Identificar el pigmento que le da color al chile guajillo por medio de una cromatografía en columna y capa fina.

RESUMEN:

Se dejo macerar chile guajillo con tolueno y se trituro para poder extraer la mayor cantidad de pigmento. Después se hizo una extracción con agua y se agrego Na2SO4 como desecante para así contener el tolueno con el pigmento lo más puro posible. Para asegurarnos de que solo se trataba de chile guajillo se llevaron muestras a una cromatografía en columna y capa fina.

INTRODUCCIÓN:

Se obtendrá una mejor identificación del pigmento cuando se encuentre el sistema de resolución adecuado de eluyentes para la cromatografía de capa fina y, se comprobara al llevar estos eluyentes a la cromatografía en columna.

La Cromatografía en columna es un proceso de separación donde la mezcla fluye hacia debajo de una columna rellena con absorbente.

En todos los casos la separación que se produce mediante esta técnica, es con frecuencia comprobable con la obtenida en la cromatografía de capa fina.

En este caso la fase móvil se llama eluyente, que es el que nos ayudará en la separación de componentes de una mezcla y este se selecciona según su polaridad.

El requerimiento básico para la cromatografía en columna es disponer de un cilindro hueco (preferentemente de vidrio, un reservorio que contenga el solvente revelador, un buen adsorbente y los medios mediante los cuales los componentes separados se puedan recoger a medida que aparezcan en el fondo de la columna.

Los usos de este tipo de cromatografía son:

• en la separación de grandes cantidades de material

• monitora la separación de la mezcla.

EN DONDE

EUYENTE COLUMNA ELUATO

ENTRA SALE

Las cromatografías son un grupo de técnicas de separación selectiva de moléculas, en las que los componentes de una mezcla compleja de componentes pueden ser identificados y/o purificados. Existen varios tipos de cromatografías, según los criterios que se usan para hacer los análisis, pero todas consisten de una fase estacionaria y una móvil.

En la cromatografía de columna las moléculas de una mezcla son separadas en base a la afinidad de las moléculas por la fase estacionaria o por la fase móvil. Si una molécula A tiene más afinidad por la fase estacionaria que la B, B bajará más rápido que A. Existen muchos tipos de cromatografía de columna.

A. Filtración en gel: En esta las moléculas son separadas por su tamaño. El gel consiste de una cama de esferas con poros de un tamaño dado. El gel se conoce como sefadex, el cual viene con poros de distintos tamaños. Las moléculas de igual o menor tamaño que el poro entran a las esferas mientras que las moléculas más grandes pasan rápidamente por la columna. Las moléculas de tamaño intermedio pueden entrar las esferas pero pasan menos tiempo en ellas. Las moléculas salen en orden de tamaño por el eluído. Aunque para efectos de este laboratorio las muestras que usaremos están coloreadas, al hacer esta cromatografía en la vida real hay que usar otras pruebas para determinar qué fracciones contienen las muestras de interés, las cuales suelen ser proteínas. Estas pruebas pueden ser mediciones fotométricas, SDS-PAGE o ensayos enzimáticos. Una vez tenemos identificadas las fracciones con las muestras,podemos hacer un "profile" de elución con concentración en con concentración en Y y el volumen de elución en X. El volumen inicial es el "void volume" de la columna. Lo que contiene es en amortiguador que estaba dentro de la columna al empezar. Las moléculas más grandes salen inmediatamente después.

El material que se escoja para la fase estacionaria dependerá del tipo de muestra que estemos corriendo. Cada tipo de gel presenta poros de distinto tamaño.

B. Intercambio iónico: Se usa para purificar proteínas. Separa moléculas en base a su carga iónica. La fase estacionaria presenta una matriz con carga. Al eluir una muestra, las moléculas de igual carga salen con el amortiguador. Las moléculas de carga opuesta se adhieren al material de empaque con distintos grados de afinidad. Para desprender las proteínas adheridas se usa una solución alta en cloruro de potasio o de sodio. Esto puede hacerse usando soluciones con incrementos moderados de salinidad, o de un solo paso, echando la solución de mayor concentración de sal primero. Al subir la concentración poco a poco podemos recolectar las muestras desde las que menos afinidad por la columna tiene hasta las de mayor afinidad. Durante la elución, la sal va compitiendo con la proteína por las cargas de la matriz de la columna, hasta que la desprende.

La columna puede ser de matriz negativa (intercambio catiónico) o positiva (intercambio aniónico). El tipo de empaque dependerá de qué queremos aislar. En este tipo de columna el pH es importante porque puede alterar la carga de la columna.

• Fase inversa: Esta es una cromatografía de interacción en la que la fase estacionaria, con moléculas hidrofóbicas, interactúa con moléculas hidrofóbicas en la muestra.

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