Cual es la Estructura y fisiología celular Actividad enzimática

Discusión

Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica y estructural  que catalizan reacciones químicas, siempre que sean termodinámicamente posibles: una enzima hace que una reacción química que es energéticamente posible, pero que transcurre a una velocidad muy baja, sea cinéticamente favorable, es decir, transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima. (Smith, 1997). En estas reacciones, las enzimas actúan sobre unas moléculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en moléculas diferentes denominadas productos. Casi todos los procesos en las células necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimáticas.

El trabajo de laboratorio consta de 2 grandes partes, la primera se basa en la curva de progreso y búsqueda de una dilución adecuada de enzima. Antes de iniciar la práctica, es necesario realizar los cálculos para concentración de producto, posterior a ello realizar la gráfica concentración vs absorbancia (curva de calibración) de la cual deriva la ecuación de la recta que se utiliza en el resto del práctico. La segunda parte en estricta relación con la primera, trata de la determinación de constantes cinéticas. Además se utilizaron ensayo de tiempo fijo o estacionario y ensayo cinético. En la primera parte se usa el ensayo cinético para ver concentración de producto y cálculo de velocidad inicial (10, 20, 30, 40 minutos). En la parte 2 se realiza el ensayo de tiempo fijo (20 min), principalmente la utilización de la gráfica de Michaelis-Menten, la cual estrictamente en condiciones de estado estacionario, es decir, cuando la concentración del complejo E-S es constante.

Además se tienen 3 tipos de enzimas, una sin diluir, 1:10 y 1:100 (razón en relación a la dilución de la enzima) son sometidas a 37ºC, simulando la temperatura óptima de la fosfatasa ácida, por teórica se conoce que la temperatura es uno de los factores que determinan la acción enzimática. Paralelo a ello, es necesario destacar que las soluciones además de la enzima, contenían 2 ml de tampón 0,1 M citrato 4,8 de pH, y 2 ml de p-nitrofenil disódico, la explicación del pH del buffer es porque de ese modo se optimiza el pH de la enzima, otro factor importante en la función de la enzima.  Posterior a ello se extraen 0,5 ml de cada solución y se mezclan con 4,5 ml de NaOH 0,1M, ahora ¿Por qué se utiliza NaOH? Porque provee el ambiente de pH adecuado para el producto, otorgándole un medio alcalino a la enzima (esto visto en la primera unidad del ramo). Observando la reacción:

[pic 1]

Esto se va repitiendo cada 10 minutos, para ver la eficiencia de la enzima a través del tiempo. La eficiencia se mide por la concentración de producto formado a una determinada concentración de sustrato, a la cual se le mide la absorbancia y usando la ecuación de la recta, se obtiene la concentración de producto. La absorbancia se mide a 405 nm, ya que el p-nitrofenolato obtiene sus máximas absorbancias a esa longitud de onda. Una vez obtenidos los resultados de la curva de progresión, es apreciable que las enzimas sin diluir y la 1:100 llegando un momento se saturan, esto se explica porque la concentración aumentaba directamente con la absorbancia, llegando a un punto donde la acción enzimática se satura curvando su gráfica cuando alcanza su “vmax” donde se describiría su asíntota, la vmax es un hecho hipotético, ya que nunca la enzima alcanza tal velocidad, la representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten (v0 frente a [S]0) es una hipérbola. La Vmax corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental, y Km corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax, como se muestra en la imagen:

[pic 2]

Esto, explica que se forme la asíntota, pues a la concentración de sustrato donde se obtiene vmax todos los sitios activos de la enzima están ocupados (saturados de sustrato), entonces aunque se siga añadiendo más sustrato, la producción de producto será la misma. En otras palabras vmax se refiere a que todo el sustrato se ha convertido en producto. Pero por Michaelis Menten la enzima al no alcanzar jamás vmáx, se puede definir un parámetro característico de la enzima empleando la concentración de sustrato a la cual se alcanza la mitad de la velocidad máxima. En tanto la enzima 1:100 al estar tan diluida, presentaba ínfimas concentraciones de la enzima por lo que la producción de producto sería igual de mínimo. Análogamente la enzima 1:10 mantiene su velocidad constante, siendo esta la más eficiente y con la que se trabajará en la segunda parte de la práctica de laboratorio. Pero queda un punto por discutir ¿Puede una enzima producir su propio inhibidor? Si es así ¿Cómo se explica esto? Sí, se puede. Aparte de información encontrada en la teórica, mediante los resultados se puede obtener esta respuesta. Como la reacción va a una velocidad constante, significa que es favorable y es "necesaria" la actividad de la enzima en ese sentido. En cambio, las demás se curvan saturándose, por lo que no están siendo favorables, entonces si no son favorables actúa en otro sentido, donde el Pi inhibe la reacción directa. Además, es importante señalar que como [ES] es constante, la velocidad de formación de los productos también es constante.

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