Cuantificación de proteínas por el método de Lowry

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Cuantificación de proteínas por el método de Lowry

Introducción

El método de Lowry (1951) es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se añade un reactivo de que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer.

Este método consta de dos etapas:

1. Los iones de Cu 2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu 2+ proteína tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El de Cu 2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato.

1. La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folín – Ciocalteau, por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. EL principal constituyente del reactivo de Folín Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotungstico, de color amarillo que al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un nuevo complejo de color azul intenso.  

Objetivo

Comprender y practicar la cuantificación de proteínas, a través de la formulación de una curva patrón, ejerciendo la técnica de pipeteo y el uso del espectrofotómetro.

Materiales

• Espectrofotómetro
• 12 tubos de vidrio
• Gradilla
• Micropipetas
• Puntas para las diferentes pipetas

Reactivos

• Solución D
• Reactivo de Folín
• (BSA) suero bovino

Composición de la solución D

La solución D se compone de 3 soluciones las cuales serán descritas a continuación:

• Solución B: Citrato de sodio al 4%
• Solución C: CuSO4 5H2O al 2%
• Solución A: Na2CO3 al 3%, NaOH al 0.1M

(Todo llevado a una proporción 1:1:48 respectivamente, adicionados siempre en el orden B:C:A)

Cálculos para la preparación de reactivos

Para la solución BSA:

5 mg de BSA             5 ml de H2O tridestilada[pic 7]

Obteniendo de esta manera suero BSA (1mg/ml)

Para solución A:

(3 g de Na2CO3           100 ml de H2O tridestilada) = Na2CO3 al 3%[pic 8]

Además se adicionan 0.4 g de NaOH a la solución anterior.

Para solución B:

(4g de Na2H (C3H5O(COO)3)      100 ml de H2O tridestilada)= Na2H (C3H5O(COO)3) al 4%[pic 9]

Para solución C:

(2 g de CuSO4            100 ml de H2O tridestilada)= CuSO4(5H2O) al 2%[pic 10]

Cálculos para la preparación de 200 ml de solución A con NaOH 0.1M

• 1er Método

Partiendo de la fórmula general

M=  = []             (1)[pic 11][pic 12]

Y sabiendo que

mol =  = []                        (2)[pic 13][pic 14]

Sustituyendo (2) en (1)

M= = []          (3)      [pic 15][pic 16]

Teniendo los siguientes datos:

M= 0.1 ( [pic 17]

L= 0.200 (L)

PM = 39.997 ( [pic 18]

Despejando para masa en la ecuación (3):

masa = (M)(L)(PM)               (4)

Sustituyendo los datos

masa = (0.1 )(0.200 L)(39.997)[pic 19][pic 20]

masa = 0.79994 g de NaOH

• 2do Método

Relación en base al peso molecular

Teniendo que a la concentración

1M            39.997 g[pic 21]

0.1M             x[pic 22]

x =  = 3.9997 g[pic 23]

Para el volumen requerido de 0.200 ml

x = 3.9997 (0.200) = 0.7994 g de NaOH

Para 200 ml de H2O utilizar 6 g de Na2CO3

Procedimiento

1. Enumerar los tubos del 1 al 12
2. Colocarlos en hielo
3. Añadir a cada tubo la solución D y el BSA según las cantidades indicadas en la siguiente tabla y mezclar.

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