DNA Plasmídico

TÍTULO DE LA PRÁCTICA

Fecha

22/AGOSTO/2014 Elaborado por:

CAROLINA BARRÓN ENRÍQUEZ

SERGIO JAVIER ARIZPE GUTIÉRREZ

RICARDO SAÚL CORPUS ESTRADA Páginas

1. OBJETIVO

• Obtener plásmido de calidad aceptable para su posterior manipulación génica, a partir de un cultivo de células.

• Conocer las bases y fundamentos del método de extracción y purificación de DNA plasmídico mediante la lisis alcalina.

2. FUNDAMENTO

El genoma bacteriano se organiza en un único cromosoma circular con un sólo origen de replicación. Las bacterias pueden contener información genética adicional en forma de plásmidos.

Los plásmidos son moléculas circulares de DNA extracromosómico que se replican de forma autónoma, a partir de su propio origen de replicación. La información genética que portan los plásmidos no es generalmente vital para la supervivencia celular. No obstante, dicha información puede resultar imprescindible en determinadas circunstancias ambientales, ejemplos: plásmidos portadores de genes de resistencia a antibióticos. Las bacterias pueden llegar a tener un gran número de copias de un mismo plásmido (plásmidos multicopia), facilitando enormemente su purificación.

Disponer de la cantidad suficiente y pureza de DNA para su manipulación es una de las prioridades de la biología molecular. El DNA genómico y plasmidico puede ser extraído de las células procariotas y eucariotas por diferentes métodos, fenol cloroformo, precipitación con alcohol Éter, polietilenglicol, etc. Uno de los más utilizados en lisis alcalina y precipitación con isopropanol que permite la extracción y separación del DNA genómico de plásmidos de bacterias.

El método de aislamiento del plásmido por lisis alcalina se basa en la naturaleza circular de los plásmidos y en el alto peso molecular del ADN cromosómico. Cuando un extracto celular se expone a un pH alcalino (cercano a 12), el ADN linear (cromosómico) se desnaturaliza mientras que el ADN circular (plásmido) permanece intacto.

Más específicamente, este método explota las diferencias en las propiedades de desnaturalización y renaturalización entre el DNA plasmídico y el DNA cromosómico.

La alcalinización con algún agente alcalino, usualmente NaOH, en presencia de un detergente fuertemente aniónico (e.g. SDS), provoca la lisis celular, la desnaturalización del DNA cromosómico y de las proteínas, y la liberación de los plásmidos. .

La neutralización del medio en presencia de una concentración alta de sal (acetato de potasio), provoca la precipitación de las proteínas (por el tratamiento con el detergente y la insolubilidad de la sal potásica del dodecil sulfato) y la del DNA cromosómico (por re-asociaciones aleatorias intracatenarias). Los agregados insolubles de proteínas y DNA cromosómico se separan por centrifugación del DNA plasmídico que queda en el sobrenadante y conserva mayoritariamente su estructura nativa.

Fig.1: Lisis alcalina: *El DNA lineal es desnaturalizado con Hidróxido de sodio a pH de 12.0/ 12.5.

*Acetato de sodio o amonio

3. MATERIALES Y EQUIPOS

Equipos

 Plancha de agitación y calentamiento

 Máquina de hielo

 Microcentrífuga

 pHmetro

 Vortex

 Transiluminador / fotodocumentador

 Cámara de electroforesis

 Fuente de poder

 Cabina de bioseguridad

 Incubadora con agitación

 Congelado -20°C



Materiales

 Tubos para microcentrífuga/ tubos eppendorf

 Tubos cónicos

 Puntillas estériles azules, amarillas

 Recipientes de unicel

 Charolas

 Espátulas

 Recipientes para desechos

 Guantes

 Gradillas de plástico

 Mechero

Material biológico, soluciones, medios de cultivo y reactivos

 E.coli DH5α- pTOPOαGLU

 Medio sólido y líquido LB

 Ampicilina

 Jugo azul

 Ampicilina 100μl/ml

 Agua MQ

 TAE 1X

 Acetato de amonio

 Etanol al 70%

 Isopropanol

 Solución 1: Tris-Cl 25 mM, EDTA 10 mM y glucosa 50 mM (pH 8)

 Solución 2: NaOH 0.2 N y SDS al 1%

 Solución 3: Acetato de amonio

 Jugo azul

 Buffer Te 1X

 Jugo azul

 Gel Red

4. PROCEDIMIENTO

Preparación del pellet

1. Tomar un cultivo de E.coli DH5α- pTOPOαGLU resembrar en medio LB+AMP e incubar a 37°C por 16 hrs.

2. Centrifugar a 14000 rpm por 5min

3. Remover el medio (1)

4. Resuspender el pellet

Protocolo de extracción

1. Resuspender el paquete celular en 200μl de Solución I. Homogenizar.

2. Dejar incubando por 5min a temperatura ambiente.

3. Agregar 400μl de solución II (2)*

4. Incubar por 5 min a 0°c

Purificación

1. Agregar

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