Determinación de la cinética enzimática
Enviado por lexer19 • 5 de Febrero de 2013 • Examen • 334 Palabras (2 Páginas) • 636 Visitas
Determinación de la cinética enzimática
De una enzima oxido reductosa
OBJETIVO:
Se realizara una cinética enzimática de la enzima polifenol oxidasa.
INTRODUCCION:
La polifenoloxidasa (E.C.1.11.1.7.) es una enzima oxidoreductasa de gran importancia en productos vegetales no solo por el papel que juega en los productos agrícolas cosechados sino también por su participación en otros procesos tales como la síntesis de lignina y su papel en aspectos fitopatológicos relacionados con resistencia a enfermedades.
MÉTODOLOGIA:
Se prepara de catecol las soluciones (una por equipo) de 0.03M, 0.04, 0.08 Y 0.175M. Con el peso molecular del catecol calcule la cantidad que deberá de usarse para preparar 50 ml en solución acuosa.
Se requiere hielo (suficiente)
En un tubo de reacción se colocaran 2 ml de solución amortiguadora de fosfatos (0.2M, Ph 6.86) a 6°C, 1 ml de solución de catecol (cada equipo lo realizará con la concentración de catecol que preparo) y 0.5 ml de extracto de enzima, esta mezcla se colocara en una cubeta de cuarzo de 3 ml e inmediatamente se medirá el incremento en la absorbancia a 420 nm con un espectrofotómetro a intervalos variables. La temperatura durante la determinación de la absorbancia se mantendrá constante a 25°C (2°C).
La velocidad de la reacción será calculada midiendo la concentración de producto (quinona) que va apareciendo por minuto, lo cual es proporcional al incremento de la absorbancia por minuto. Se representara la absorbancia contra el tiempo y se calculara la pendiente (velocidad inicial de la reacción) de la porción lineal del grafico mediante regresión lineal.
Una unidad de actividad de PFO (U) será definida como la cantidad de enzima capaz de producir un cambio en la absorbancia de 0.001 por minuto y por mililitro de extracto y se calcula multiplicando la pendiente (m, velocidad inicial de la reacción) por 2 (factor de conversión a milímetro) y por 1000 (conversión de la absorbancia a unidades de activación por lo que:
U=m(2000)
Calculando la actividad enzimática para cada concentración de sustrato se construirá gráficamente la cinética enzimática (actividad enzi vs. Concentración sustrato) para calcular la Km y Vmax.
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