Practica Cinética Enzimatica

INTRODUCCION:

Muchos estudiantes de biología tienen un “miedo” inherente a la cinética enzimática porque requiere habilidad para manejar ecuaciones algebraicas básicas; asimismo, se les dificulta comprender el significado de los datos cuantitativos de la cinética, obtenidos generalmente “in vitro”, en relación con lo que ocurre en la célula viva. Es verdad que con frecuencia hay mucha información en los datos cinéticos, con teorías muy generales y, a menudo, dudosas acerca de la función de las enzimas en la célula. Un ejemplo es el glutamato deshidrogenasa, responsable de la asimilación del amoniaco. Frecuentemente se informa que esta enzima tiene una Kmalta, poca afinidad por el substrato amoniaco, con un valor de hasta 40 mM. Esta Kmalta se obtuvo con 1 mM α-oxoglutarato y 1µM de NADH. Sin embargo, si se hubiera querido ser más real, se hubieran usado concentraciones de substrato in vivo, por ejemplo, 0.11 mM α-oxoglutarato y 1µM de NADH, la Km para el amoniaco sería de aproximadamente 3-4 mM. A partir de este ejemplo resulta claro que las condiciones empleadas para medir la actividad enzimática deben variar en un intervalo amplio de condiciones fisiológicas antes de concluir acerca de la función de una enzima in vivo.

El estudio de la cinética enzimática puede producir mucha información importante, particularmente cuando se combina otras técnicas, relacionada con el mecanismo 14 de acción de una enzima, la forma en que responde una enzima a cambios fisiológicos en la concentración de substrato y cómo puede controlarse o regularse la actividad de una enzima bajo condiciones fisiológicas. Para los biotecnólogos interesados en el uso de enzimas aisladas o de sistemas enzimáticos para el rompimiento de substratos (celulosa) o para la formación de productos (jarabes ricos en fructuosa), la importancia de la cinética enzimática es clara en la determinación de las condiciones óptimas para la actividad enzimática y para la determinación de las rapideces de conversión óptimas. Es decir, el conocimiento de los datos cinéticos permite diseñar el proceso catalizado por enzimas de manera que se logre la máxima, o el máximo económico, conversión de los substratos en productos.

Las enzimas son proteínas con la capacidad de manipular otras moléculas, denominadas sustratos. Un sustrato es capaz de unirse al centro catalítico de la enzima que lo reconozca y transformarse en un producto a lo largo de una serie de pasos denominados mecanismo enzimático. Algunas enzimas pueden unir varios sustratos diferentes y/o liberar diversos productos, como es el caso de las proteasas al romper una proteína en dos polipéptidos. En otros casos, se produce la unión simultánea de dos sustratos, como en el caso de la ADN polimerasa, que es capaz de incorporar un nucleótido (sustrato 1) a una hebra de ADN. Aunque todos estos mecanismos suelen seguir una compleja serie de pasos, también suelen presentar una etapa limitante que determina la velocidad final de toda la reacción. Esta etapa limitante puede consistir en una reacción química o en un cambio conformacional de la enzima o del sustrato.

El conocimiento adquirido acerca de la estructura de las enzimas ha sido de gran ayuda en la visualización e interpretación de los datos cinéticos. Por ejemplo, la estructura puede sugerir cómo permanecen unidos sustrato y producto durante la catálisis, qué cambios conformacionales ocurren durante la reacción, o incluso el papel en particular de determinados residuos aminoácidos en el mecanismo catalítico. Algunas enzimas modifican su conformación significativamente durante la reacción, en cuyo caso, puede ser crucial saber la estructura molecular de la enzima con y sin sustrato unido.

El estudio cuantitativo de la catálisis enzimática, que se denomina cinética enzimática, proporciona información sobre las velocidades de reacción. Los estudios cinéticos miden también la afinidad de las enzimas por los sustratos y los inhibidores, y proporcionan conocimientos sobre los mecanismos de reacción. La cinética enzimática tiene varias aplicaciones prácticas, que incluyen una mejor comprensión de las fuerzas que regulan las rutas metabólicas y el diseño de tratamientos más adecuados.

La velocidad de la reacción anterior es proporcional a la frecuencia con la que las moléculas reaccionantes forman el producto.

Otro término que es útil para describir una reacción es el orden de la reacción. El orden se determina de forma empírica, es decir, mediante experimentación. Se define como la s8uma de los exponentes de los de concentración en la expresión de velocidad. La determinación del orden de una reacción permite a un experimentador obtener determinadas conclusiones con relación al mecanismo de la reacción. Se dice que una reacción sigue una cinética de primer orden cuando la velocidad depende de la primera potencia de la concentración de un único reactante y sugiere que el paso limitante de la velocidad es una reacción unimolecular

La actividad específica de una enzima, una magnitud que alcanza para controlar la purificación de la enzima, se define como el número de unidades internacionales por miligramo de proteína.

La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos.

La mayoría de las enzimas se nombra en términos de la reacción que cataliza. Se acostumbra añadir el sufijo –asaa una parte importante del nombre del sustrato sobre el que la enzima actúa. Por ejemplo, la enzima que cataliza la descomposición de la urea es ureasa y la que ataca la tirosina es la tirosinasa. Existen tres tipos principales de reacciones enzimáticas:I.

Enzima soluble-sustrato insolubleII.

Enzima insoluble-sustrato solubleIII.

Enzima soluble-sustrato soluble

Un ejemplo de reacción de tipo I es el uso de enzimas como las proteasas o amilasas en los detergentes para la ropa; sin embargo, esta reacción enzimática ha causado cierta controversia en relación con la contaminación del agua. Una vez en solución, la enzima soluble podría dirigir (es decir, descomponer) un sustrato insoluble como una mancha de sangre. Actualmente se está intensificando la investigación de las reacciones tipo II. Al unir grupos enzimáticos activos a superficies sólidas se pueden crear unidades de procesamiento continuo similares al reactor de lecho catalítico empacado que veremos en el capitulo 10.Es evidente que la más intensa actividad en el estudio de las enzimas ha estado relacionada

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