EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EUCARIOTAS EN LA LEVADURA PICHIA PASTORIS

EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EUCARIOTAS EN LA LEVADURA PICHIA PASTORIS[pic 1]

D. Becerra Cely, H. López Acosta, K. López Monsalve, S. Mora Ardila, C. Pachón Cubaque, J. Rodríguez Jackson.

Departamento de Farmacia, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá

10 de Julio de 2019

helopeza@unal.edu.co, klopez@unal.edu.co, smoraa@unal.edu.co, cjpachoncu@unal.edu.co, dbecerrac@unal.edu.co

Abstract

By definition, yeasts are eukaryotic unicellular fungi that exhibit great diversity according to  their cell diameter, shape and color. Certain yeasts can be used in recombinant eukaryotic protein expression systems which allow them to obtain large amounts of proteins with homologous characteristics of the native ones by using genetic engineering techniques and cell culture. Pichia pastoris is a species of methylotrophic yeast that belongs to the family Saccharomycetaceae which is used in this process given the advantages it has compared to others. The specific case of the cloning, sequencing and expression of the Glycoprotein G gene in yeast Pichia Pastoris as a secretion protein will be discussed.

Key words:  Pichia Pastoris, Glycoprotein G, recombinant eukaryotic protein expression.

Los sistemas de expresión de proteínas eucariotas mediante tecnología recombinante es un proceso que permite, como su nombre lo explica, producir proteínas de interés para llevar a cabo diversos estudios, por ejemplo: estructurales, funcionales, de interacción entre proteínas, entre otros. Este proceso, a través de ingeniería genética y cultivo celular, permite obtener proteínas con características específicas  que se deseen investigar para posteriormente aplicar este conocimiento en el campo terapéutico, creación y desarrollo de medicamentos los cuales dan una muy prometedora aproximación al tratamiento de enfermedades producidas por la deficiencia de una proteína en particular. El enfoque de este proyecto es específico para la expresión de proteínas eucariotas en levaduras que presentan ciertas ventajas, ya que este proceso también se puede llevar a cabo en otros organismos como las bacterias donde estas al ser procariotas, no tienen la capacidad de hacer modificaciones postraduccionales como la glicosilación. Por lo tanto, levaduras como la Saccharomyces cerevisiae se empezaron a usar con el fin anteriormente mencionado, mas esta glicosilación difiere mucho de la glicosilación humana por lo que otras levaduras no-convencionales como la Pichia Pastoris han sido utilizadas recientemente. [1] 

Una de las categorías incluidas dentro de las levaduras no convencionales son las levaduras metilotróficas, entre la que encontramos a Pichia Pastoris esto hace referencia a las cepas capaces de emplear el metanol como fuente de carbono y de energía; adaptación relacionada con la presencia de genes que codifican para enzimas involucradas en la degradación del metanol. [2] 

Varios estudios han demostrado que el metabolismo del metanol en levaduras metilotróficas, requieren la expresión de un grupo de enzimas, entre las cuales está la enzima alcohol oxidasa (AOX I)[2]. Esto permite anticipar que la síntesis de AOX I podría ser regulada a nivel transcripcional y que el promotor para el gen podría ser útil para controlar la expresión de genes foráneos.

La regulación del metabolismo del metanol en los organismos metilotróficos es un proceso complejo que incluye la síntesis, la activación y la degradación de las enzima involucradas. Estas enzimas son inducidas por metanol, formaldehído y formato (efectores positivos). Sin embargo, la actividad de la enzima alcohol oxidasa es disminuida por la glucosa y el etanol (efectores negativos). El primero de estos mecanismos involucra el control sobre la síntesis de RNA y el segundo, la inactivación o degradación de enzimas. La formación de acetato como consecuencia de la utilización del etanol reprime la expresión de la alcohol oxidasa mientras que se agota.^[a]

Para la producción de proteínas heterólogas en P. pastoris, normalmente se emplea el esquema de tres fases en cultivos de alta densidad, es decir que el medio contiene una alta cantidad de Pichia Pastoris. En la primera fase (fase de crecimiento) la levadura recombinante es cultivada en medios salinos suplementados con un alcohol de azúcar no fermentable como el glicerol (cultivo discontinuo). La utilización de glicerol resulta en la producción de etanol y acetato [3]. Una vez que el glicerol es consumido se inicia la fase de transición; en esta se alimenta de glicerol en cantidades que mantengan el crecimiento exponencial limitado por sustrato. En la tercera fase generalmente se adiciona metanol en concentraciones limitadas, lo que debe resultar en la expresión de la proteína recombinante.

La P. pastoris es capaz de crecer en glicerol, metanol y etanol como únicas fuentes de carbono y energía, de esta manera se estableció la prioridad de utilización de las diferentes fuentes de carbono, glicerol > etanol > metanol. [4]

La levadura Pichia Pastoris tiene la capacidad de expresar distintas proteínas que tienen aplicación en la industria biofarmacéutica. Generalmente es usada en la expresión de anticuerpos vacuna como lo muestra en la figura 1.

Los sistemas de expresión en P. pastoris son usados para producir fragmentos de anticuerpos funcionales de cadena simple (scFv), los cuales representan moléculas potenciales dirigidas al desarrollo de medicamentos, toxinas o radionucleidos y  el acoplamiento de lisosomas cuyo fin son las aplicaciones en el diagnóstico y la terapéutica. Por otro lado, los estudios con levaduras como organismos modelo, permiten inducir mutaciones y observar los daños celulares a lo largo de generaciones en pocos días y la experimentación con fármacos con rápidos resultados.

La levadura Pichia Pastoris tiene la capacidad de realizar modificaciones postraduccionales más parecidas a las humanas, en especial en los procesos de glicosilación, no segrega grandes cantidades de proteínas endógenas, lo que además facilita el proceso de purificación. A su vez tiene la capacidad de inducir fácilmente su promotor a partir de metanol.[pic 2]

Figura 1. - Aplicaciones de la P. pastoris en la industria biofarmacéutica. El diagrama muestra diferentes líneas de investigación el la industria de la salud que usa como modelo de expresión recombinante la P. pastoris. HPV: Human Papillomavirus; Single-Chain Fragment Variable; BCRP: Breast Cancer Resistance Protein.[9]

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