EXTRACCIÓN DE ADN: MÉTODO SALTING OUT CON ANÁLISIS ELECTROFORETICO

EXTRACCIÓN DE ADN: MÉTODO SALTING OUT CON ANÁLISIS ELECTROFORETICO

Cruz Pineda Kelly 1

1Estudiante del programa de Biología, Facultad de Ciencias Básicas, Universidad del Atlántico: kilómetro 7 Antigua Vía Puerto Colombia, Barranquilla - Colombia

1. RESUMEN

Se extrajo ADN genomico de una muestra sanguínea, utilizando el método salting-out, el cual se llevo a cabo mediante 2 protocolos, con presencia y ausencia de Proteinasa K. Durante el proceso de precipitación de DNA, fue posible observar mayor cantidad de DNA en las muestras que no contenían Proteinasa K. Posteriormente se llevo a cabo el proceso de electroforesis, donde fue muy evidente la presencia de DNA visualizado en las 4 bandas con  ausencia de la enzima.

Palabras claves: DNA, Extracción,  Salting-Out, Proteinasa K,Electroforesis

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2. INTRODUCCIÓN

En los últimos años los avances realizados en el campo de la genética molecular, han mejorado de forma notable el conocimiento de los mecanismos fisiopatológicos y el diagnostico de distintas enfermedades. En el DNA se encuentra toda la información genética de un individuo; por tanto, el primer paso para llevar a cabo un estudio de genética molecular implica la extracción de ácidos nucleicos, especialmente el DNA.

Los métodos de extracción de ácidos nucleicos son sencillos, pero es importante mantener una serie de precauciones para evitar la degradación por nucleasas durante la manipulación. En los últimos años las casas comerciales han desarrollado diversos kits de obtención de DNA a partir de sangre, todo tipo de tejidos y  cultivos celulares que permiten optimizar los procedimientos para obtener un DNA de buena calidad y en el menor tiempo posible. Hasta la fecha, los diferentes métodos de extracción de ADN de células sanguíneas reportados varían ampliamente. Estos métodos se basan, en su mayoría, en el uso de solventes orgánicos tóxicos, como fenol/ cloroformo para la separación de ácido nucleico de las proteínas y demás componentes celulares (Sambrook J) .

Desde hace dos décadas se han reportado otros métodos que eliminan proteínas y contaminantes celulares, empleando una alta concentración de sales tales como NaCl o Acetato de sodio, con resultados similares, sin la toxicidad de los solventes orgánicos. Uno de estos métodos fue reportado por Miller en 1988 ( Miller SA, ) y es conocido con el nombre de purificación salina” (del inglés, salting out). El ADN se aísla mediante precipitación en presencia de alcohol isopropanol o etanol y se disuelve en agua o en una solución tamponada que puede contener conservantes del ADN, tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) ( Gross-Bellard M ). El ADN es normalmente aislado de la capa leucocitaria o las muestras de linfocitos, los cuales se obtienen por purificación previa por centrifugación o filtración en gradientes de densidad.

Ademas este método  requiere el uso de la electroforesis, lo que supone una parte importante del procedimiento sistemático del análisis (separación, purificación, preparación) de los ácidos nucleicos y las proteínas. La mayoría de las biomoléculas poseen una carga eléctrica cuya magnitud depende del pH del medio en el que se encuentran; como consecuencia, pueden desplazarse cuando se someten a un campo eléctrico hacia el polo de carga opuesta al de la molécula.  A diferencia de las proteínas, que pueden tener una carga positiva o negativa, los ácidos nucleicos sólo poseen carga negativa, debido a su esqueleto de fosfatos.

Por lo tanto, en una electroforesis, los ácidos nucleicos migrarán hacia el polo positivo, es decir, el ánodo. En el caso de las proteínas, que suelen ser de carga neutra, se realiza pretratamiento con detergentes, como el dodecilsulfato de sodio (SDS), que les confiere carga negativa; con ello se homogeneizan las proteínas de la muestra y todas migrarán hacia el polo positivo; sólo se separarán por tamaño.

Mediante la electroforesis podemos separar fragmentos de ADN en función de su tamaño, visualizarlos mediante una sencilla tinción, y de esta forma determinar el contenido de ácidos nucleicos de una muestra, teniendo una estimación de su concentración y grado de entereza. Además es posible  extraer del gel los fragmentos de ADN que sean de interés, para posteriormente utilizarlos en diferentes aplicaciones.  La electroforesis de ADN fue, y sigue siendo, una herramienta de importancia primordial en el desarrollo de las técnicas del ADN recombinante o ingeniería genética. La idea de utilizar la técnica de electroforesis a través de una matriz para analizar muestras de ADN corresponde a Vin Thorne, un bioquímico del Instituto de Virología de Glasgow, quien a mediados de los años 60 del pasado siglo estaba interesado en caracterizar las distintas formas de ADN que se obtenían de partículas purificadas de polyomavirus. Su razonamiento era que una combinación de fuerzas eléctricas y de fricción permitiría el desplazamiento y separación en función del tamaño o topología de diferentes moléculas de ADN (Thorne 1966, 1967).

3. MATERIALES Y MÉTODOS

 Para la extracción de DNA  se realizaron 2 protocolos .

•  Extracción de DNA por salting-out

Se obtuvo una muestra de sangre con anti coagulante (EDTA) y se tomaron alícuotas de 500 μl y 200 μl para repartirlas en 12 tubos eppendorf ( Figura 1) . Cada una de estas alícuotas fue tratada con una solución de lisis de glóbulos rojos (LGR)  (1000  μl )  , para proceder a incubarlos en frio por 10 minutos,  luego se efectuó una centrifugación a 16000 rpm durante 2 minutos, descartándose el sobrenadante. Se repitió el proceso de centrifugación , pero ahora a 14000 rpm  y se realizaron 3 lavados con LGR. Posteriormente se procedió a lisar los leucocitos mediante tratamiento con una solución de lisis conteniendo buffer de glóbulos blancos , añadiéndole a cada tubo 300  μl, esta solución   ya contenía SDS, que se encarga de desnaturalizar la membrana. A los tubos A y B se le agregó 2,5 μl de Proteinasa K, incubándose a 55 °C toda la noche y a los tubos C no se le agregó Proteinasa K y se incubaron a 4 °C toda la noche.

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Figura 1. Tubos eppendorf con distintas alícuotas de sangre

A : 500  μl, B: 200  μl, C: 200  μl

Después de la completa digestión, se  agrego a cada tubo 200  μl de acetato de sodio, se agito y centrifugo a 6000 rmp por 2 minutos. El sobrenadante de los 4 tubos A, se transfirieron a un tubo Falcon de propileno, descartándose el botón proteico,  y el sobrenadante de los tubos B Y C se transfirió a otros tubos eppendorf  . A todos los tubos se le agrego isopropanol frio y se mezclo por suave inversión, pero el tubo A se colocó en la centrifugadora por 10 minutos. Se  agrego a todos los tubos 100  μl de poliacrilamida lineal, el cual funciona como un coprecipitador y se centrifugaron por 1 minuto a 16000 rmp los tubos B Y C. Posteriormente se descarto el isopropanol y el precipitado del tubo Falcon , se transfirió a un tubo eppendorf.  Cada precipitado de DNA se lavo con  600  μl de etanol, se centrifugo a 16000 rmp por 1 minuto y por ultimo se dejo secando el DNA dentro de la cámara de flujo laminar.

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