El PCR (Polimerase Chain Reaction) es una técnica de duplicación (amplificación)

Amplificación de la región variable V6-V8 del gen 16SrDNA por PCR y DGGE

El PCR (Polimerase Chain Reaction) es una técnica de duplicación (amplificación) exponencial de DNA ó RNA. Se utiliza como enzima a la Taq-polimerasa, un cebador o primer que se une a la región de material genético que se desea duplicar y nucleótidos que la enzima Taq-polimerasa va uniendo.

Otra herramienta, el DGGE (Denaturing Gradient gel electrophoresis), nos permite separar fragmentos previamente amplificados por PCR, que presentan diferencias mínimas en su secuencia de nucleótidos. Esta técnica se basa en la migración diferencial de las moléculas de DNA a través de un gel de poliacrilamida que contiene concentraciones crecientes de agentes desnaturalizantes como formamida ó urea (Kazuya et al, 2000). Esta diferencia puede ser de un solo nucleótido. La desnaturalización total del DNA se evita uniendo al DNA un broche o clamp de guanina y citosina (G-C) que impide la desnaturalización total.

Algunos investigadores combinan la utilización de PCR y DGGE con técnicas para la extracción de DNA, para caracterizar microorganismos presentes en pastizales ingleses (Robert et al., 2000, Allison. et al, 2001).

La extracción de DNA de la muestra nos permitió tipificar a los microorganismos que se encontraban en el suelo, y en la técnica de DGGE se usaron como testigos positivos para la comparación con las muestras de DNA de la población total. La extracción del DNA de las cepas aisladas se llevó a cabo con el kit de extracción de DNA WIZARD de Promega. Los extractos de DNA se analizaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1%

Extracción del DNA

La técnica de extracción de DNA Lisozima-SDS-Bead Beating, combina tres formas posibles de extraer DNA. La lisis enzimática (lisozima), por surfactante (SDS) y mecánica (Bead-Beater). Por la complejidad de la muestra que se trabajó se decidió escoger la combinación de estas tres técnicas técnica para garantizar una cantidad elevada y representativa de la misma (Wade et al., 1996)

Análisis de restricción enzimática (PCR-REA)

El análisis de restricción enzimática nos permitió hacer una discriminación del total de cepas aisladas, agrupando a las cepas con los mismos patrones de restricción, disminuyendo la cantidad de cepas a utilizar para los comparativos en los geles de DGGE. Las enzimas que se utilizaron reconocen secuencias de 4 pares de bases, disminuyendo la cantidad de secuencias repetidas aumentando la probabilidad de que tales sitios se encuentren en el gen 16S rRNA

Amplificación por PCR para la región V6-V8 del gen 16S rRNA  y técnica DGGE

Primers para la región V6-V8 del gen 16S rRNA

 GC 968 forward: 5´-GCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGAACGCGAAGAACCTTACC- 3´ UNI 1401 reverse:  5´- GCGTGTGTACAAGACCC -3´

La técnica de DGGE nos permitió obtener geles de poliacrilamida con bandas representativas de la región V6-V8 del gen 16S rRNA de los consorcios, asociadas cada una a un microorganismo diferente en especie y grupo, estos patrones de bandas se analizaron para obtener un estimado de la dinámica de poblaciones del suelo además de obtener un comparativo con las bandas de la región V6-V8 del gen 16s rRNA para las cepas aisladas.

...