Electroforesis De Campo Pulsante

INTRODUCCIÓN

La electroforesis es la migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo eléctrico; estas partículas migran hacia el cátodo o ánodo (electrodos – y +), dependiendo de su carga, pero también depende de otros factores como ser: su peso molecular y estructura tridimencional.

La electroforesis es un método analítico-semipreparativo que permite separar biomoléculass, las macromoléculas más utilizadas son las proteínas y los ácidos nucleicos, ya que ambos tipos presentan una carga importante, algo que no presentan los lípidos, sin contar con que son insolubles.

“La electroforesis de ácidos nucleicos” es el método habitual para separar, identificar y purificar moléculas o fragmentos de ADN y ARN. En los tampones habitualmente utilizados, los ácidos nucleicos están cargados negativamente y migran hacia el ánodo. Cada molécula aporta una carga negativa (procedente del grupo fosfato), por lo que la relación carga/tamaño es prácticamente constante e idéntica para todas las moléculas, independientemente de su tamaño. Así, un nucleótido tendrá la misma movilidad que un fragmento de doble cadena de 800pb o uno de 5kb.

La electroforesis de ADN, se lleva a cabo en geles de agarosa o poliacrilamida. Ambos soportes son restrictivos para los ácidos nucleicos, de modo que los diferentes fragmentos (al tener la misma relación carga/tamaño), van a migrar en función de su tamaño y/o conformación.

• Los geles de poliacrilamida (en cubetas verticales) se emplean para fragmentos pequeños de ADN (5-500pb), así como para la mayoría de los ARN.

• Los geles de agarosa (en cubetas horizontales) se utilizan para fragmentos grandes de DNA (500pb-10Mb); utilizando agarosas de distintas concentraciones (distinto grado de reticulación) pueden separarse fragmentos de hasta 50kb aplicando un campo eléctrico constante.

En 1984, Schwartz y Cantor desarrollaron un sistema denominado ELECTROFORESIS EN GEL DE CAMPO PULSANTE (PFGE) que permite separar fragmentos de ADN de tamaño superiores a 50kb mediante la aplicación de un campo eléctrico que NO es constante sino que cambia periódicamente, debido a que aún si son capaces de entrar en el gel no avanzarían casi nada al quedar “enganchadas” en la trama del gel, por muy poco concentrado que se encuentre. Así, cambiando la dirección y/o el sentido del vector campo eléctrico en forma de pulsos, se logra que la molécula vaya cambiando de dirección y/o sentido de la migración sacándola de los “atolladeros”, y por lo tanto haciendo que se mueva.

ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSANTE O PULSED-FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE)

1-FUNDAMENTOS Y VARIANTES TÉCNICAS

Durante los años 70, se observó que bajo la acción de un campo eléctrico, las moléculas de ADN se reorientaban y se desplegaban avanzando en dirección al polo positivo. Cuando el campo eléctrico cesaba, las moléculas de ADN se relajaban recuperando su estado inicial. La aplicación de un segundo campo eléctrico, con una orientación distinta del primero, obligaba al ADN a cambiar su conformación y reorientarse de nuevo para poder avanzar en la dirección del segundo campo eléctrico. El tiempo requerido para esta reorientación era dependiente de la longitud de la molécula, esto es de su peso molecular. Tras el cambio de orientación del campo eléctrico, las moléculas grandes tardan más tiempo en alinearse y poder comenzar el avance a través del gel de lo que tardan las moléculas de ADN más pequeñas, Es decir: “cuanto mayor sea el tamaño de los fragmentos a separar, mayor ha de ser la duración de los campos aplicados”.

Mientras los campos eléctricos que se alternen tengan “la misma intensidad y voltaje”, la migración final del ADN se recogerá en forma de línea recta, aunque el patrón final de separación de los fragmentos revelará la suma de todos los avances cortos en "zig-zag" que el ADN ha realizado. Este principio fue el que llevó a Schwartz y Cantor en 1984 a la descripción de las técnicas de PFGE y su utilidad en la separación de moléculas grandes de ADN, del orden de varios cientos de kb.

TÉCNICA UTILIZADA EN UNA PFGE

Los fragmentos de ADN son sometidos a dos campos eléctricos de distinta orientación:

 Primero, se aplica un campo eléctrico (E1) durante cierto tiempo, los fragmentos se estiran y se orientan según la dirección de dicho campo.

 Luego, se aplica un segundo campo (E2), perpendicular al anterior, obligando a los fragmentos a relajarse y elongarse y alinearse de acuerdo con este segundo campo eléctrico. Cuanto menos tarde una molécula en reorientarse, antes migra en la dirección de E2; el tiempo que se consume en esta reorientación depende del tamaño de los fragmentos, tardando más los mayores.

 Aplicando sucesivos cambios de campo eléctrico (E1/E2/E1/E2/E1/E2 etc.) se consigue la separación de los fragmentos en función de su tamaño.

El ángulo α que forman las direcciones de los campos eléctricos E1 y E2 se denomina ángulo de reorientación, y determina

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