Electroforesis

Bioquímica II - Electroforesis

Introducción

Técnica que sirve para separar macromoléculas por su peso molecular.

Ác. Nucleicos →

Proteínas →

Medida que avanzan por el gel, se separan, cuanto mayor sea el peso, menor será la velocidad de la molécula en dicho medio.

Las que estén más cerca del borde del gel, se ubicarán las moléculas de menor peso.

Western Blot

Electroforesis SDS-PAGE

SDS desnaturaliza y da carga negativa a las proteínas.

PAGE, gel de polietilamida.

Con frecuencia es necesario detectar pequeñas cantidades de un proteína en particular.

Separar macromoléculas usando la electroforesis en gel. Duración media hora.

Segundo paso es el western blot

Proteínas se transfieren a una membrana.

Lavados con anticuerpos, antígenos reconocidos por distintos anticuerpos. Reconocer nuestra proteína.

Anticuerpos – antimiosina.

Primer lavado sobre la membrana, noche entera incubándose.

Serie de lavados, anticuerpos en exceso no den un ruido de fondo.

Anticuerpo secundario reconoce a su vez al anticuerpo primario, tienen unida alguna molécula que produce color.

Película fotográfica por encima.

El término blotting se refiere a la transferencia de muestras biológicas.

Western blotting se usa normalmente para identificar positivamente una proteína específica en una mezcla compleja y para obtener

El wb se usa extensivamente en investigación para:

Determinar la presencia de proteínas específicas

Cuantificar sus niveles de expresión

Y determinar si han experimentado modificaciones genéticas o post-traduccionales.

Identifica proteínas de interés basándose en dos características distintivas:

-peso molecular

-especificidad a los anticuerpos.

Después de la electroforesis las proteínas se visualizan añadiendo azul de Coomassie, se fija las proteínas y no al gel.

Formación de geles

Primero se fabrica un gel inferior, conocido como resoluing gel, después de polimerizase se fabrica el stacking gel. Se forma una banda estrechita.

Separación de mezclas complejas de proteínas:

Electroforesis de proteínas en dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE)

Marcadores de pesos moleculares.

Concentración de poliacrilamida

Tampones de electroforesis.

Persulfato amónico hay que prepararlo antes de usarlo, pesarlo y diluirlo justo antes de hacer el gel.

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