Electroforesis

Practica 1 : electroforesis

INTRODUCCIÓN

La electroforesis esuna técnica de separación de moléculas en una mezcla por aplicación de un campo eléctrico. Las moléculas disueltas se desplazan o migran en un campo eléctrico a una velocidad determinada por su relación carga:masa (Lodish, 2006).

Existen tres tipos de electroforesis: de frente móvill, zonal y continua.

En la electroforesis de frente móvil, las macromoléculas están presentes en toda la disoluci{on y su posición ( el frente que separa la disolución del disolvente) se determina en función del tiempo por óotica de schlieren. Este método es una técnica analítica que ha sido utilizada principalmente para la determinación delas movilidades y puntos isoeléctricos de las proteínas. Sin embargo, dada la poca utilidad de la dterminación cuantitativa de la movilidad, la electroforesis de frente móvil es muy poco usada (Freifelder, 1981).

En la electroforesis zonal, la disolución a tratar se aplica como una mancha, o como una banda, y las particulas migran a través de un disolvente utilizando además un medio soporte inerte y homogenéo, tal como el papel o ciertos tipos de geles. Esta técnica es urilizada para analizar muestras, para determinar la pureza de una muestra, para detectar cambios de movilidad o de conformación y para la purificación de sustancias (Freifelder, 1981).

En la electroforesis continua, la muestra se aplica también en una zona, pero se añade continuamente a lo largo del proceso. El uso de los geles como el almidón,poliacrilamida, agarosa y agarosa-acrilamida como medios de soporte proporciona una inestableresolución, particularmente para proteínas y ácidos nucleicos.Los primeros trabajos en gel se realizaron utilizando geles de almidón, despues de la electroforesis el gel se corta en dos o tres capas en sentido longitudinal y se somete a distintas tinciones. Los principales componentes se de la muestra inicial aparecen como una serie de bandas en el gel. Actualmente se utilizan muy poco los geles de almidón, debido a que han sido sustituidos en gran parte por los depoliacrilamida (Freifelder, 1981).

Los geles de poliacrilamida han reemazado a los de almidón por su mejor efecto como tamiz molecular y por proporcionar el control del tamaño de sus poros utilizando concentraciones distintas de los monómeros de partida. La poliacrilamida es corrientemente el medio desoporte más efectivo para la electroforesis de proteínas y pequeñas moléculas de RNA (Freifelder, 1981).

Los geles de agarosa se usan para separar por electroforesis grandes moléculas. Lo poros muy grandes necesarios para la separación por page de compuestos de masas moleculares grandes requieren que los geles tengan una concentración de poliacrilamida tan baja que son demasiado blandos para manipularse. Esta dificultad se soluciona por el uso de agarosa. Por ejemplo para la separación electroforética de ácidos nucleicos se usa gel agarosa (Voet, Voet, Pratt, 2007).

OBJETIVO

-Familiarizarse con métodos de separación de ácidos nucleicos mediante electroforesis en geles de agarosa.

MATERIAL

Tampón de electroforesis TBE (Tris-borato).

Agarosa.

Bromuro de etidio

Tampón de carga de las muestras.

Marcadores de peso molecular.

Micropipetas automáticas y puntas desechables para las mismas.

Equipo de electroforesis (cubeta, soporte, peine, fuente de alimentación).

Transiluminador de luz UV

Equipo de tratamiento de imagen y fotografía térmica.

METODOLOGÍA

-Se quita la cinta adhesiva con la que se ha sellado el soporte del gel y

se coloca en la cubeta de electroforesis. ¡¡OJO!!: Los pocillos deben de estar

cerca del cátodo (polo negativo, color negro).

- Se añade tampón de electroforesis TBE, de forma que cubra bien el gel

de agarosa.

- Se aplican 10 µl de la muestra preparada en el apartado anterior en dos

de los pocillos.

- Se aplican 10 µl de marcadores de peso molecular en dos de los

pocillos.

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