Electroforesis

Es uno de los métodos más empleados para separar fragmentos de ADN, esta técnica se basa en el hecho de que el ADN se encuentra cargado negativamente debido a los grupos fosfatos, como consecuencia, cuando se aplica un campo eléctrico el ADN se desplaza desde el polo negativo hacia el polo positivo, esta separación se lleva a cabo en una matriz sólida (el gel de agarosa). Existen distintos factores que afectan a la velocidad con que el ADN migra en el gel, entre ellos se puede citar:

• Tamaño de la molécula
• Concentración de agarosa
• Conformación del ADN

Para llevar a cabo el proceso necesitaremos:

Materiales:

• Guantes
• Juego de micropipetas y puntas
• Microondas
• Cubeta de electroforesis
• Molde de electroforesis
• Fuente de alimentación
• Microviales
• Captador de imágenes
• Agarosa ultrapura
• Etc

Tampón TBE: Su dos primeros componentes mantienen el pH, el EDTA captura el Mg++, evitando que las nucleasas destruyan el DNA ya que ellas lo manejan como un co-factor enzimático.

• Tris base
• Ácido bórico
• EDTA

Tampón de carga:

• Sacarosa
• Azul de bromofenol
• EDTA

Agarosa y bromuro de etidio a una concentración de 0.5g/mL

Marcador de pesos moleculares para poder determinar el tamaño de los fragmentos obtenidos

PROCEDIMIENTO

• Pesar la agarosa en polvo sobre una balanza analítica
• Disolverla en el volumen apropiado de tampón TBE, de forma que el gel tenga la concentración adecuada, en función del tamaño de fragmentos que se pretenda separar
• Se mezcla y se calienta en microondas hasta hacerla hervir (repetir hasta que deje de ser espesa)
• Se espera que enfríe un poco (para no romper el porta-geles)
• Se coloca un borde en la parte abierta del porta geles (ya sea conseguido comercialmente o hecho con cinta adhesiva de papel)
• Se vierte la solución en un porta-geles que servirá como molde para el gel
• Colocar un peine (que éste no llegue al fondo) para formar los pocillos en los que se depositará la muestra.

MIENTRAS EL GEL SOLIDIFCA

★Se preparan las muestras para cargarlas en el gel

• Se añade a cada muestra (que es aprox. 25 l) el tampón de carga, que tiene como objetivo aumentar la densidad de la muestra, de forma que esta permanezca en el pocillo una vez depositada debido a la sacarosa o el glicerol que incluye el tampón; también permite ver el frente de avance del gel gracias al colorante azul que contiene, para determinar el momento en que debemos detener la corriente y finalizar el proceso de separación. (10l de muestra + 3l de buffer de carga)

★Una vez solidificado el gel se retira el peine

• Se retira el peine y se coloca en el cubeta de electroforesis
• Dentro de la cubeta el gel debe quedar cubierto por tampón TBE, cuyas sales son las que permitirán el establecimiento de la corriente
• Cada muestra (y escalera/marcador) se coloca en uno de los pocillos formados previamente en el gel con el peine.

★Ya cargadas todas las muestras

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