Electroforesis

ELECTROFORESIS

La electroforesis es un método de separación que se basa en la velocidad de migración diferencial de especies cargadas en un campo eléctrico de cd aplicado. Esta técnica de separación para muestras de gran tamaño fue desarrollado por el químico sueco Arne Tiselius en la década de los treinta, para el estudio de las proteínas séricas: en 1948 ganó el premio Nobel de química por su trabajo.

Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo).

El movimiento de las moléculas está gobernado también por dos fuerzas adicionales; inicialmente la fricción con el solvente dificultará este movimiento originando una fuerza que se opone , por otro lado las moléculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen energía cinética propia denominado difusión. La energía cinética de las moléculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusión.

La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una manera homogénea, de tal manera que, si las moléculas son colocadas en un cierto lugar de solución, los iones comenzaran a moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo.

La electroforesis en escala macro se ha aplicado en varios problemas de separaciones difíciles, aniones, cationes inorgánicos, aminoácidos, catecolaminas, fármacos, vitaminas, carbohidratos, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, nucleótidos, poli nucleótidos y muchas otras especies. Una característica única de la electroforesis es su capacidad para separar macromoléculas cargadas de interés bioquímico, biológico y biotecnológico, durante muchos años, la electroforesis ha sido el mejor método para la separación de proteínas (enzimas, hormonas, anticuerpos) y de ácidos nucleicos (ADN, ARN), para los que ofrece una resolución sin igual.

Con los métodos de electroforesis se separan las sustancias de acuerdo con sus relaciones de carga a masa usando el efecto de un campo eléctrico sobre las cargas de esas sustancias. Estos métodos se utilizan mucho para separar partículas coloidales cargadas o iones macromoleculares. Hay varios tipos de electroforesis, y la electroforesis de zona es uno de los más comunes.

En la electroforesis de zona, las proteínas están suspendidas en un sólido, de manera que además de las fuerzas eléctricas de migración, las fuerzas cromatografías convencionales pueden influir sobre la eficiencia de la separación. Hay varios tipos de electroforesis de zona, de acuerdo con los diferentes soportes. Entre los soportes comunes están los geles de almidón, geles de poliacrilamida, espuma de poliuretano y papel. La electroforesis en gel de almidón es una técnica difundida, aunque hoy ha sido sustituida en parte por el uso de los geles de poliacrilamida que minimizan los efectos de convección y difusión. Se prepara un bloque o placa de gel y la muestra se aplica en forma de una banda angosta que cruza el bloque, cuando se hace pasar corriente por la celda, los diversos componentes de las mezclas se mueven con velocidades que dependen de sus cargas eléctricas, tamaños y formas. Al avanzar la electroforesis, los componentes con carga negativa migran hacia el ánodo, y los que tienen carga positiva migran hacia el cátodo. El resultado es una serie de bandas o líneas separadas debidas a los componentes de la muestra, que se visualizan como una mancha.

Molécula ADN

Se pueden resolver mezclas muy complejas con electroforesis. Por ejemplo la separación electroforética en gel de las proteínas plasmáticas muestra 18 componentes. Para medir la intensidad de las zonas coloreadas y con ella obtener información cuantitativa se puede usar un densitómetro. La electroforesis capilar en gel es una poderosa variante de este método.

Proteínas

La velocidad de migración de cada sustancia depende del voltaje aplicado y del pH de la solución amortiguadora empleada. El voltaje aplicado se expresa en voltios por centímetro. Es hasta 500 V en electroforesis de bajo voltaje, y puede ser de varios miles de voltios en la electroforesis con alto voltaje. Esta última se usa para tener separaciones rápidas de sustancias de bajo peso molecular. Las macromoléculas tienen menores movilidades iónicas y son menos propensas a separaciones con alto voltaje.

Equipo para electroforesis

La electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida es la técnica principal para separar mezclas complejas de proteínas de acuerdo con su carga y después con base en su tamaño molecular. La muestra se coloca en la parte superior de un tubo de gel para su resolución inicial usando un enfoque isoeléctrico, donde las proteínas se mueven en un campo eléctrico de acuerdo con su carga (sus puntos isoeléctricos). Hay un gradiente de pH inmovilizado en el gel que mejora la eficiencia de la separación cambiando la carga a medida que las proteínas descienden por el gel, de manera muy parecida a como lo hace la programación de temperatura en la cromatografía de gases. Después de esta primera separación unidimensional, se coloca el gel encima de un gel de poliacrilamida y dodecil sulfato de sodio, y las proteínas en cada posición en el gel de enfoque isoeléctrico se siguen separando por electroforesis de acuerdo con su tamaño. Esta separación bidimensional se basa en principios de separación ortogonal, y permite obtener resoluciones muy altas. Se pueden separar varios miles de proteínas o de grupos de proteínas.

PRINCIPIO

CAMPO ELECTRICO

Definimos el campo eléctrico como aquella región del espacio en la que cualquier carga situada en un punto de dicha región experimenta una acción o fuerza eléctrica.

El campo eléctrico, introducido por primera vez por Faraday en la primera mitad del siglo XIX, constituye frente a la ley de Coulomb una forma nueva de describir la interacción entre dos cargas eléctricas en reposo:

la ley de Coulomb es una ley de acción a distancia, como la ley de la gravitación universal de Newton para la interacción gravitatoria entre dos masas puntuales: según la ley de Coulomb, cuando tenemos una cierta carga puntual q, y situamos otra carga puntual q0 a una cierta distancia r de la primera, la carga q0 experimentara´ de forma instantánea y a distancia una fuerza que, según

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