Epidemiologia De Treponemas

EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR DE TREPONEMAS ORALES ASOCIADOS CON ENFERMEDAD PERIODONTAL

La periodontitis, una enfermedad responsable por la pérdida dental en todo el mundo, se caracteriza por inflamación crónica del periodonto, llevando con el tiempo a la destrucción de los ligamentos periodontales y del hueso alveolar de soporte. Las espiroquetas , identificadas en la microscopía de campo oscuro como las bacterias más predominantes en las lesiones avanzadas, se considera que juegan un papel causal. Varios morfotipos de espiroquetas fueron observados, pero la mayoría de estos morfotipos aún no son cultivables. Para evaluar el rol de estos organismos diseñamos sondas de oligonucleótidos para la identificación de espiroquetas cultivables y, hasta ahora, no cultivables en pacientes con periodontitis. Los especimenes de la placa subgingival tomados de sitios enfermos (n=2000) y de sitios control sanos (n=44) de 53 pacientes con periodontitis rápidamente progresiva (PRP) fueron sometidos a hibridización directa in situ o a hibridización dot blot después de amplificación previa con cebadores eubacteriales. Las espiroquetas fueron encontradas en todos los pacientes, pero sus distribuciones variaron considerablemente. El uso paralelo de sondas de oligonucleótidos específicas para treponemas cultivables o para treponemas hasta ahora no cultivables sugirió la presencia de organismos nuevos aún desconocidos a una alta frecuencia. Estos treponemas no cultivables fueron visualizados mediante hibridización in situ por fluorescencia , y sus morfología, tamaños, y cantidades pudieron ser estimados. Todos los pacientes con PRP incluídos en este estudio albergaban treponemas orales que representan especies nuevas, por ejemplo, Treponema maltophilum, o filotipos no cultivables. Por tanto, es necesario incluir a estos organismos en las consideraciones etiológicas y fortalecer los esfuerzos para cultivar estos como también los treponemas no cultivables.

Los treponemas comprenden un gran grupo de espiroquetas encontradas en infecciones importantes como la sífilis o la enfermedad periodontal. Mientras que el papel de Treponema pallidum en la patogénesis de la sífilis está bien documentada, el papel etiológico de los treponemas orales en la periodontitis es postulado con base en la presencia de cantidades elevadas de estos organismos en las lesiones periodontales. Las espiroquetas predominan en la mayoría de pacientes que tienen enfermedad periodontal crónica pero que no han respondido a la terapia. Aunque varios morfotipos de espiroquetas han sido observados, la mayoría de estos no han sido cultivados. Entre las cuatro especies de treponemas orales cultivables actualmente reconocidas, Treponema denticola ha sido asociado con mayor frecuencia con la enfermedad periodontal crónica. Sin embargo, aún queda por determinar si este organismo es de relevancia etiológica o simplemente es el organismo más fácilmente cultivado. Los análisis genéticos moleculares recientes revelaron una diversidad inesperada de secuencias de treponema en una muestra de placa subgingival de un paciente con periodontitis. Más de 50 secuencias de ARNr de treponema fueron encontrados, y estos agrupados en ocho grupos taxonómicos principales (Grupos I a VIII) Los análisis genéticos moleculares recientes revelaron una diversidad inesperada de secuencias de treponema en una muestra de placa subgingival de un paciente con periodontitis. Más de 50 secuencias de ARNr de treponema fueron encontrados, y estos agrupados en ocho grupos taxonómicos principales (Grupos I a VIII) Los análisis genéticos moleculares recientes revelaron una diversidad inesperada de secuencias de treponema en una muestra de placa subgingival de un paciente con periodontitis. Más de 50 secuencias de ARNr de treponema fueron encontrados, y estos agrupados en ocho grupos taxonómicos principales (Grupos I a VIII) Sintetizamos una cantidad de sondas de oligonucleótidos específicas del grupo o específica del filotipo para determinar la frecuencia de organismos conocidos y nuevos en las muestras de placa subgingival de 53 pacientes con periodontitis rápidamente progresiva (PRP) mediante hibridización dot blot o hibridización in situ.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestras clínicas. Se investigó un total de 244 especímenes de placa subgingival (200 especímenes de bolsas periodontales profundas y 44 especímenes de sitios control sanos) de 53 pacientes con PRP (edad promedio, 34.7 años). Todos los pacientes no estaban tratados previamente. Los pacientes recibieron un diagnóstico de PRP de acuerdo con su apariencia clínica y radiográfica avanzada en combinación con su edad y su historia de enfermedad periodontal, siguiendo los criterios de Page y cols. Los pacientes que tenían enfermedad crónica o los pacientes que habían recibido terapia anti-inflamatoria o antimicrobial dentro de los 6 meses anteriores fueron excluidos del estudio. Las muestras de placa subgingivales fueron tomadas de sitios enfermos con una profundidad de bolsa de sondeo de ≥ 6 mm y sangrado al sondeo. Siempre que fue posible se seleccionó una muestra de un sitio control adicional no afectado clínicamente por la enfermedad. Después de la remoción de la placa subgingival con una cureta estéril y una torunda de algodón, tres puntas de papel estériles (ISO 35: Becht, Offenburg, Alemania) fueron insertadas en las bolsas. Después de 10 segundos las puntas de papel fueron removidas y puestas en 1 ml de fluido de transporte reducido que contenía glucosa 25%, se transfirieron al laboratorio, y se procesaron inmediatamente.

Microscopía de campo oscuro . El conteo total de células bacteriales en todas las muestras fue estimado mediante microscopía de campo oscuro. El número de espiroquetas fue determinado semicuantitativamente como conteos por campo microscópico a una amplificación de 1.000X.

Extracción y amplificación de ADN. Las alícuotas del espécimen de placa de 100 l fueron centrifugados a 13.000 x g durante 10 minutos en una centrífuga Labofuge 400 R (Hereus, Hanau, Alemania). Las partículas bacteriales resultantes fueron puestas en 100 l de búfer para lisis como se describió previamente. Ninguna purificación adicional de ácidos nucléicos fue realizada. Se añadió un microlitro de ADN en volumen a la mezcla de amplificación (volumen de reacción final, 100 l) para amplificación in vitro mediante PCR en un ciclador térmico (Trioblock; Biometra, Göttingen, Alemania) durante 30 ciclos de desnaturalización (1 minuto, 95ºC), alineamiento (1 minuto, 56ºC), y extensión (1 minutos, 72ºC). Los cebadores eubacteriales de rango amplio usados para la amplificación del gen ARNr 16S fueron TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3´: correspondiendo a las posiciones 8 a 27 en el gen ARNr 16S de Escherichia coli) y RTU3 (5´-GWA TTA CCG CGG CKG CTG-3´;

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