Evalucación De Antioxidantes De Polifenoles De Algas Marinas

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE POLIFENOLES DE

ALGAS MARINAS

EVALUATION OF ANTIOXIDANT ACTIVITY OF POLYPHENOLIC

COMPOUNDS FROM MARINE ALGAE

Argimiro Rivero Rosales

Facultad de Ciencias del Mar (Universidad de Las Palmas de Gran Canaria). Edificio Ciencias

Básicas. Campus de Tafira s/n. 35017 Las Palmas de Gran Canaria (España)

arivero@dqui.ulpgc.es

Juana Rosa Betancort Rodríguez

Instituto Tecnológico de Canarias. Playa de Pozo Izquierdo s/n. 35119 Santa Lucía. (España)

RESUMEN

La formación de radicales libres mediante procesos naturales conduce a la oxidación de

biomoléculas, dando lugar a diversas enfermedades. Los organismos fotosintéticos están

expuestos a ambientes muy oxidativos, por lo que poseen un sistema antioxidante muy eficaz.

Presentamos en este trabajo un sencillo método para la extracción y evaluación de la actividad

antioxidante de los polifenoles de algas marinas. La concentración de polifenoles se determina

siguiendo el método de Folin-Ciocalteu, y la medición de la actividad antioxidante se realiza por

el método del DPPH.

INTRODUCCIÓN

La excesiva oxidación de biomoléculas da lugar a diversos daños en el organismo (1). Así, un

exceso de radicales libres se ha relacionado con una mayor incidencia de diversas

enfermedades degenerativas (1) como cáncer, enfermedades cardiacas, inflamación, artritis,

disfunción cerebral, aceleración del envejecimiento (2), etc.

El mecanismo por el que los radicales libres producen sus efectos transcurre mediante una

reacción radicalaria, en la que se forman especias reactivas oxigenadas, que son los que

producen los efectos nocivos. Este proceso se ve favorecido por la presencia de oxígeno y de luz

ultravioleta, que inicia la formación de radicales libres.

La utilización de antirradicales permite que no se produzcan las especies reactivas oxigenadas

(por esto, también se les suele llamar antioxidantes), de forma que se impiden las consecuencias

de su actividad (3,4). Estos antirradicales actúan principalmente en reacciones de terminación de

cadenas de radicales libres. Impidiendo la oxidación de lípidos y otras moléculas cediendo

átomos de hidrógeno de forma que se neutralizan los radicales libres.

La naturaleza ofrece una gran oportunidad para el descubrimiento de nuevos compuestos

naturales con diversas actividades (5), especialmente en aquellas zonas con una gran flora

autóctona (6). Las plantas y algas marinas están sometidas a una intensa radiación ultravioleta y

una alta concentración de oxígeno en su entorno. Pero los efectos nocivos de los radicales libres

producidos en estas condiciones, son neutralizados por antioxidantes naturales (7).

En esta práctica se pretende estudiar la actividad antioxidante de algas marinas, ya que es bien

conocido que las algas pardas (Phaeophyta) poseen altas concentraciones de compuestos

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antioxidantes (8,9,10) formados por polímeros de unidades de floroglucinol (1,3,5-

trihidroxibenceno) y denominados polifenoles.

OBJETIVOS

En esta práctica se extraerán polifenoles de algas marinas y se valorará su concentración y

actividad antioxidante mediante tres pasos

• Extracción de polifenoles

• Determinación de la concentración de polifenoles en los extractos

• Determinación de la capacidad reductora de los extractos

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS

Algas marinas pardas (frescas o desecadas)

Espectrofotómetro UV-visible y cubetas de cuarzo

Nevera

Balanza

Agitador

Material básico: Matraces aforados de 10 mL

Erlenmeyer 250 mL

Probeta 100 mL

Pipetas de 0.05, 0.5 y 10 mL

Filtración a vacío

Disolventes: Agua destilada

Metanol

Reactivos: Ácido acético glacial

Na2CO3 20 %

Floroglucinol [CAS nº: 108-73-6]

Reactivo Folin- Ciocalteu [MDL nº: MF CD00132625]

Polivinilpolipirrolidona (PVPP) [CAS nº: 25249-54-1]

2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) [CAS nº: 1898-66-4]

MÉTODO

I) Extracción de polifenoles de algas pardas:

Se pesan 3-4 g de algas pardas secas (o 40–50 g de alga fresca recién recolectada) y se trocean

en pequeños trozos. Se añaden 100 mL de agua/metanol (1:1), se homogeniza y se agita

durante 24 h en nevera. Posteriormente, se filtra a vacío, recogiendo el extracto final, del que

debe medirse el volumen obtenido.

II) Determinación de la concentración de polifenoles en el extracto algal

El procedimiento a seguir consiste en el método Folin-Ciocalteu (11), donde la concentración de

polifenoles se detecta mediante formación de sales de tungsteno y molibdeno, cuantificable en

espectrofotometría a 760 nm. Para evitar posibles interferencias, se tratará parte de la muestra

con polivinilpolipirrolidona (PVPP) insoluble, que se une específicamente a los polifenoles en

medio ácido. De esta forma, la diferencia de absorbancias entre el extracto tratado y no tratado

con PVPP refleja la concentración de polifenoles.

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II.a) Recta de calibrado de floroglucionol

Se prepara una disolución de floroglucinol (1mg/mL) en agua/metanol (1:1). A partir de esta

disolución, se preparan cinco disoluciones (concentraciones 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 y 0.6 mg/mL) que

junto con una muestra control de disolvente, se someten a la reacción de Folin-Ciocalteu de la

siguiente forma: se toma 1 mL de cada disolución, se mezcla con 0.5 mL del reactivo Folin-

Ciocalteu y 1.5 mL de Na2CO3 al 20 %, enrasando con el disolvente hasta 10 mL. Estas nuevas

disoluciones se mantendrán en oscuridad durante una hora para que se produzca la reacción. Se

mide la absorbancia de cada muestra en el espectrofotómetro a longitud de onda de 760 nm.

Una vez tratados los datos de absorbancia, se obtiene la recta [Floroglucinol] = (a × Abs760) + b

II.b) Determinación de la concentración de polifenoles en el extracto algal

Se toman 30 mL del extracto y se llevan a pH 3.5–4.0 con ácido acético glacial. La disolución

resultante se separa en dos partes A y B. La Fracción A se guarda en oscuridad y se reserva. A

la fracción B se le añade PVPP (15 mg por mL de extracto), se agita y se filtra a vacío, repitiendo

la operación otras dos veces. Las dos fracciones A y B deben someterse a la reacción de Folin-

Ciocalteu. Para ello, se procede igual que en el apartado anterior: se toman 1 mL de la fracción,

se añaden 0.5 mL del reactivo Folin-Ciocalteu y 1.5 mL de Na2CO3 al 20 % y se enrasa a 10 mL.

Estas disoluciones se mantienen en oscuridad durante 1 h, y posteriormente se lee en el

espectrofotómetro a 760 nm.

A partir de la absorbancia obtenida de las dos fracciones y de la recta de calibrado de

floroglucinol, podemos determinar la concentración de polifenoles en las disoluciones

preparadas. A partir de estas concentraciones, y aplicando los factores de dilución que se han

ido acumulando, se determina la concentración de los polifenoles en el alga ensayada.

III) Ensayo de la actividad antioxidante

En este ensayo, se evalúa la capacidad que tiene un posible antioxidante para neutralizar un

radical (12). El compuesto 1,1-difenil-2-pricrilhidrazil (DPPH) es un radical estable que presenta

una intensa coloración violeta y que absorbe radiación a 517 nm, de forma que su concentración

se puede determinar mediante métodos espectrofotométricos (13). En el ensayo se determina la

concentración inicial de DPPH y la concentración resultante una vez que se ha añadido el

posible antioxidante, de forma que una disminución de la absorción de radiación se traduce en

una disminución de la concentración de DPPH debida a la cesión de electrones de la especie

antioxidante.

IIIa) Recta de calibrado de DPPH

Se prepara una disolución de DPPH 0.1 mM en metanol. A partir de esta disolución, se preparan

cinco disoluciones de un volumen de 10 mL de concentraciones 0.02, 0.04, 0.06, 0.08 y 0.1 mM.

Además, se prepara un BLANCO que únicamente tiene 10 mL de disolvente. Se debe medir la

absorbancia de estas disoluciones a una longitud de onda de 517 nm para obtener la recta que

determina la concentración de radical: [DPPH] = (a x Abs517)+ b

IIIb) Determinación de actividad antioxidante de los extractos algales

Se introducen en la cubeta del espectrofotómetro 2 mL de la disolución de DPPH 0.1 mM. Se le

añade 0.05 mL del extracto de alga obtenido previamente y se va leyendo la absorbancia a 517

nm. Si la disminución de absorción es muy rápida, se realizará una dilución apropiada del

extracto. Se determinará el tiempo en que la concentración de DPPH se reduce a la mitad (t½) y

el porcentaje de inhibición a los 30 minutos, calculado como [Ao-Ae)/Ao] x 100, donde Ao es la

absorbancia sin extracto y Ae es la absorbancia con extracto.

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