Exclusión

Fundamento

Se fundamenta en el tamaño y/o forma de las moléculas a separar, siendo la fase estacionaria un material poroso y forzosamente inerte, que permite la discriminación de los analitos según el tamaño de estos. Cuando la molécula es mucho más grande que los poros de la fase estacionaria, esta se podrá eluir únicamente pasando por el exterior de la estructura del material poroso, eluyendo con una gran velocidad, mientras que las moléculas de tamaño menor al poro quedarán retenidas un tiempo en la matriz de la red cristalina (formada por entrecruzamientos) por lo que su elución será tardía y después a la otra molécula, logrando la separación y/o purificación.

Objetivos

Determinar algunos parámetros que caracterizan al lecho cromatográfico.

Efectuar la desalación de la albúmina, utilizando la técnica de cromatografía por exclusión

Resultados

Tabla 1. Determinación del volumen vacío (Vo) de la columna.

A 615 Absorbencia coregida Volumen de elución (mL)

0 0.004 3

0.002 0.006 6

-0.003 0.001 9

-0.004 0 12

-0.004 0 15

0.36 0.364 18

0.675 0.679 21

0.301 0.305 24

0.078 0.082 27

0.017 0.021 30

0.004 0.008 33

Para corregir la absorbancia se considero el valor absoluto de la absorbencia más baja (siempre y cuando este fuera menor a cero), y se le sumo a toda la serie de valores.

Gráfico 1.

Con este gráfico observando directamente el volumen en el que se tiene máxima absorbencia podemos conocer el volumen vacío.

¿Cuál fue el volumen total de la columna (VT)?

De la fórmula πr^2 h

Donde:

r= 1cm h = 24 cm

Tenemos entonces:

24π=75.3984 〖cm〗^3

¿Cuál fue el volumen vacio Vo? ¿Cuál es su importancia?

Como ya se dijo este volumen es de 21 mL y sale directamente del gráfico siendo este el volumen que se forma entre las superficies de las esferas del gel, y por el que las moléculas de gran tamaño pasaran siendo eluidas, por lo que es fundamental conocerlo, además de su utilización en los cálculos.

Determinación del volumen del líquido interno del gel (Vi) y el volumen del gel solo (Vg).

Para esto tenemos que Vi será calculado de la siguiente manera.

Para cada gramo de Sephadex® hidratado se necesitan 5 mL (dato de fabricante) y necesitamos saber para 75.3948mL cuantos gramos de gel hidratado hay entonces:

Gi=(1g (75.3984 mL))/5mL=15.0796 g de gel hidratado.

Ahora por cada gramo de este gel se tienen 2.5 mL de agua retenida (dato de fabricante) y necesitamos conocer para 15.0796 gramos cual es el volumen de agua retenida por lo que:

Vi=(15.0796 g (2.5mL))/1g=37.6992 mL

Y por último de la ecuación:

V_T=Vo+Vg+Vi

Despejamos Vg (volumen del gel únicamente).

Vg=V_T-Vo-Vi

Y sustituimos quedándonos:

Vg= 75.3984-21-37.6992=16.6992 mL

Tabla2. Separación de sulfato de amonio y la albúmina

Volumen de elución (mL) A 280 A 280 ajustada Masa del tubo vacio (g) Masa del tubo con precipitado (g) Sulfato de amonio (mg)

3 0 0.009

6 -0.002 0.007

9 -0.009 0

12 0.011 0.02

15 0.009 0.018

18 0.152 0.161

21 0.48 0.489

24 0.147 0.156

27 0.029 0.038

30 0.02 0.029 7.5788 7.596 17.2

33 0.01 0.019 8.5924 8.6459 53.5

36 0.001 0.01 6.7172 6.7833 66.1

39 0 0.009 8.7783 8.8327 54.4

42 9.3981 9.4173 19.2

45 8.737 8.7495 12.5

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Ahora procedemos a realizar el perfil de elución para ambos compuestos con los valores en la tabla, del cual podremos conocer a simple vista si se llevo a cabo una separación, una buena o mala separación, comparar y comprobar lo visto teóricamente sobre la técnica, y la eficacia en el trabajo práctico.

Gráfica 2.

Informe

¿Qué sustancia eluyó primero y cual después? Explique por qué.

En el perfil de elución podemos observar claramente que la máxima concentración de albúmina eluyó a un volumen de 21 mL (coincidiendo con el volumen vació calculado anteriormente con la dextrana azul) mientras que la máxima concentración de sulfato de amonio eluyó a un volumen de 36 mL (esto observado en los picos de el perfil de elución)

Por lo que eluyó primero toda la albúmina (molécula de gran tamaño) y se dejo para después el sulfato de amonio (molécula de mucho menor tamaño).

¿Qué es un gel? ¿Qué características debe tener el que es cromatográficamente útil?

Son sistemas semisólidos que consisten de suspensiones compuestas por partículas inorgánicas pequeñas o moléculas orgánicas grandes, interpenetradas por un líquido.

También podemos decir que es un polímero tridimensional en forma de red, que al ponerse en contacto con fases acuosas es insoluble pero las absorbe y se hincha, su forma de red se da por entrecruzamientos entre cadenas de polímeros, dependiendo del grado de entrecruzamiento será el tamaño del poro del gel.

En una cromatografía por exclusión un gel debe cumplir los siguientes requisitos.

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