Facultad de Oceanografía, Pesquería, Ciencias Alimentarias y Acuicultura

CULTIVOS MENORES –  CULTIVO DE TETRASELMIS SP

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Alumna: Alexandra Nájar Alcántara

Docente: Ing. Manuel Figueroa

Escuela Profesional de Ing. en Acuicultura

Facultad de Oceanografía, Pesquería, Ciencias Alimentarias y Acuicultura

Universidad Nacional Federico Villarreal

2016

Resumen

El objetivo de este informe fue aprender a desarrollar un buen cultivo de microalga marina, siendo en este caso Tetraselmis sp; así como de los procedimientos para la preparación del medio Guillar f/2, extracción correcta de la muestra y del conteo respectivo para calcular la biomasa aumentada por día. El desarrollo del cultivo es sumamente importante para las especies hidrobiológicas correspondientes para el desarrollo de la Acuicultura, sobre todo en su estado larvario por lo que hace imprescindible el buen desarrollo de la preparación, así como de las cantidades adecuadas y proporcionales del medio. Además el conocimiento y control de los parámetros ambientales óptimos, así como de los agentes externos son muy importantes regulando así la concentración y calidad de este cultivo. El conteo día a día del aumento de biomasa de  Tetraselmis sp empleando la cámara de Neubauer fue desarrollado en el laboratorio de Cultivos Menores, donde se tuvo como resultados a partir de la concentración celular por mililitro el desarrollo normal de la curva del crecimiento poblacional; por lo que se concluye que el cultivo fue acertado a pesar que solamente se observaron cinco fases: Rezago, aceleración exponencial que fue el quinto día con una cantidad de 9,78E+04cel/ml, la fase de retardo y por último la fase estacionaria máxima que fue el onceavo día con 29,78E+04cel/ml, esto se debió a que en el proceso de traslado del matraz a la botella fue muy  poco, adicionando a esto que durante el proceso tuvo poca luminosidad.

Palabras clave: Cultivo de microalgas, Tetraselmis sp, medio Guillard f/2, conteo, cámara de Neubauer, microscopio monocular, crecimiento poblacional, fases.

Objetivos

Objetivo general:

• Aprender a cultivar una microalga marina, en nuestro caso Tetraselmis sp.

Objetivos específicos:

• Reconocer el momento de realizar la limpieza y desinfección previa antes de preparar el medio de cultivo.

• Preparar el medio de cultivo Guillard “F/2” para Tetraselmis sp (microalga marina) con las proporciones correctas.

• Extraer correctamente la muestra, para el conteo de las microalgas.

• Aprender a utilizar correctamente la cámara de Neubauer.

• Aprender a contar a través de la cámara de Neubauer.

• Determinar la concentración celular de cada día.

• Realizar correctamente la curva de desarrollo de la microalga Tetraselmis sp.

Procedimiento:

• Para la preparación de nutrientes (medio Guillard f/2):

1. Se preparó la solución de nitratos:

• Se pesó 18,750g de NaNO3 en la balanza analítica.
• Se adicionó agua destilada al beacker que contenía el NaNO3 para diluirlo y se mezcló con ayuda de la bagueta.
• Se trasladó el contenido a una  fiola de 250ml colocando la bagueta entre la fiola y el beacker para que ingrese la solución directamente a la fiola sin tener pérdidas, para esto la bagueta se introduce un poco solamente sin chocar con las paredes de la fiola.
• Se enjuagó el beacker con un mínimo de tres veces y se adicionó a la fiola empleando de igual manera la bagueta.
• Se enrasó la fiola y se homogenizó tapando con papel aluminio.
• Se rotuló la fiola.

1. Se preparó la solución de fosfatos:

• Se pesó 12,5g de NaH2PO4.H2O en la balanza analítica.
• Se adicionó agua destilada al beacker que contenía el NaNO3 para diluirlo y se mezcló con ayuda de la bagueta.
• Se trasladó el contenido a una  fiola de 250ml colocando la bagueta entre la fiola y el beacker para que ingrese la solución directamente a la fiola sin tener pérdidas, para esto la bagueta se introduce un poco solamente sin chocar con las paredes de la fiola.
• Se enjuagó el beacker con un mínimo de tres veces y se adicionó a la fiola empleando de igual manera la bagueta.
• Se enrasó la fiola y se homogenizó tapanco con papel de aluminio.
• Se rotuló la fiola.

1. Se preparó las trazas de metales quelatados:

• Se pesó 0,7875g de FeCl3.6H2O; 1,09 g de Na2.EDTA; 0,98 g de CuSO4 (cobre); 2,2 g de Zn SO4 (zinc); 18 g de CoCl2 (cobalto) y 0,63 g de Na2MoO4 (molibdato) en la balanza analítica.
• Se adicionó agua destilada al beacker que contenía el NaNO3 para diluirlo y se mezcló con ayuda de la bagueta.
• Se trasladó el contenido a una  fiola de 250ml colocando la bagueta entre la fiola y el beacker para que ingrese la solución directamente a la fiola sin tener pérdidas, para esto la bagueta se introduce un poco solamente sin chocar con las paredes de la fiola.
• Se enjuagó el beacker con un mínimo de tres veces y se adicionó a la fiola empleando de igual manera la bagueta.
• Se enrasó la fiola y se homogenizó tapanco con papel de aluminio.
• Se rotuló la fiola.

1. Se preparó las vitaminas:

• Se abrió la ampolla que contenía el color amarillo y se extrajo con la jeringa.
• Se echó a la fiola sin tocar las paredes.
• Se adicionó agua destilada a la ampolla para su respectivo enjuague y con la jeringa se volvió a extraer y se echó a la fiola. Se repitió tres veces.
• Se abrió la ampolla que contenía el color rojo y se extrajo con la jeringa.
• Se echó a la fiola sin tocar las paredes.
• Se adicionó agua destilada a la ampolla para su respectivo enjuague y con la jeringa se volvió a extraer y se echó a la fiola. Se repitió tres veces.
• Se enrasó la fiola con agua destilada (que se encontraba en la piseta).
• Se homogenizó tapando con papel aluminio y se rotuló.

1. Cada fiola con sus nutrientes se colocaron en la refrigeradora.

• Para cultivar en los tubos de ensayo:

1. Se realizó la limpieza y desinfección de la mesa de trabajo (empleando detergente, lejía y alcohol), aplicando lo aprendido anteriormente.
2. Se prendió el mechero bunsen.
3. Se extrajo un litro de agua de mar esterilizada (la cual previamente se recolectó cerca de la Rosa Náutica, ubicada en el circuito de playas en el distrito de Miraflores, que se dejó reposar al menos una semana antes de esterilizar)  y se tapó con papel aluminio.
4. Se añadió 1 ml de nitratos, 1 ml de fosfatos, 1 ml de trazas de metales quelatados y 0,5 ml de vitaminas. Se mezclaron.
5. Se desinfectó con alcohol la mesa de trabajo.
6. Se rotuló dos tubos de ensayo, uno con la letra “A” y otro con la letra “T”.
7. Se cogieron los dos tubos, se sacaron los tapones, los cuales se colocaron entre los dedos, se flamearon las aberturas de los dos tubos en el mechero bunsen; a su vez se cogió el vaso de precipitado con el medio Guillard f/2, se sacó el papel de aluminio y se flameó el pico, se vertió un poco (menos de la mitad) del medio preparado a ambos tubos. Acabado ello se prosiguió tapar cada tubo (aplicando la fuerza de empuje para el cierre en el tubo, mas no en el tapón de algodón).

Utilizando el Asa de Kolle:

1. Se desinfectó con alcohol la mesa de trabajo.
2. Se cogió el tubo rotulado con la letra “A” junto con el tubo de la cepa, se quitaron los tapones conteniéndolos en una mano y los tubos en la otra, sin contacto entre ellos, luego se flamearon las aberturas de los tubos.
3. Se cogió el asa de Kolle y se calentó en el mechero bunsen(al rojo vivo).
4. Se esperó un momento para que se enfríe y se introdujo al tubo con la cepa (en medio y sin agitar).
5. Se retiró el asa de Kolle cuidadosamente sin que choque con las paredes del tubo y se trasladó al tubo rotulado con la letra “A” hasta el medio aproximadamente y se agitó dentro. Se repitió por tres veces desde que se cogió el asa de Kolle y se calentó al mechero bunsen, hasta terminar en el tubo rotulado con la letra “A”
6. Se flamearon las aberturas de los dos tubos y se taparon con sus respectivos tapones (aplicando la fuerza de empuje para el cierre en cada tubo, mas no en los tapones de algodón).

De tubo a tubo:

1. Se desinfectó con alcohol la mesa de trabajo.
2. Se cogió el tubo rotulado con la letra “T” y el tubo con la cepa.
3. Se sacó los tapones de ambos tubos procurando que no haya contacto entre estos (uno en cada mano), de la misma forma con los tubos (uno en cada mano).
4. Se flamearon las aberturas de ambos tubos y se pasa un chorro del tubo con la cepa al tubo rotulado con la letra “T”.
5. Se flamearon las aberturas de ambos tubos y se taparon (aplicando la fuerza de empuje para el cierre en cada tubo, mas no en los tapones de algodón).

• Se dejaron los dos tubos en una gradilla cerca al fluorescente (luminosidad).
• Se agitó los tubos de ensayo por dos semanas día a día para que las microalgas no se adhieran  a las paredes, para evitar sedimentación  y para distribuir oxígeno, teniendo en cuenta de que no se realicen movimientos  muy bruscos para que no se moje y caiga algodón.
• Se lavó cada material empleado para poder esterilizarlos nuevamente(aplicando lo aprendido anteriormente), así como se filtró y esterilizó más agua de mar reposada.

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• Para cultivar en el matraz de Erlenmeyer:

1. Se realizó la limpieza y desinfección de la mesa de trabajo (empleando detergente, lejía y alcohol), aplicando lo aprendido anteriormente.
2. Se prendió el mechero bunsen.
3. Se extrajo un litro de agua de mar esterilizada  y se tapó con papel aluminio.
4. Se añadió 1 ml de nitratos, 1 ml de fosfatos, 1 ml de trazas de metales quelatados y 0,5 ml de vitaminas. Se mezclaron.
5. Se desinfectó con alcohol la mesa de trabajo.
6. Se rotuló el matraz de Erlenmeyer.
7. Se cogió el matraz de Erlenmeyer  y se sacó el tapón, el cual se colocó entre los dedos; se flameo la abertura del matraz de Erlenmeyer en el mechero bunsen; a su vez se cogió el vaso de precipitado con el medio Guillard f/2, se sacó el papel de aluminio y se flameó el pico, se vertió un  poco (menos de la mitad) del medio Guillard f/2 al matraz de Erlenmeyer. Acabado ello se prosiguió a tapar el matraz de Erlenmeyer y el vaso de precipitado.
8. Se desinfectó con alcohol la mesa de trabajo.
9. Se cogió el matraz de Erlenmeyer  junto con el tubo de ensayo rotulado con la letra “T” (cepa nueva), debido a que estaba más concentrado que el tubo rotulado con la letra “A” y se quitaron los tapones conteniéndolos una en cada mano, sin contacto entre ellas, luego se flamearon las aberturas del matraz de Erlenmeyer y del tubo.
10. Se pasó un único chorro del tubo con la nueva cepa al matraz de Erlenmeyer.

1. Se flamearon las aberturas del matraz de Erlenmeyer y del tubo y se taparon (aplicando la fuerza de empuje para el cierre en el matraz de Erlenmeyer y en el tubo, mas no en los tapones de algodón).
2. Se dejó el matraz de Erlenmeyer cerca al fluorescente (luminosidad).

1. Se agitó el matraz de Erlenmeyer por una semana día a día para que las microalgas no se adhieran  a las paredes, para evitar sedimentación  y para distribuir oxígeno, teniendo en cuenta de que no se realicen movimientos  muy bruscos para que no se moje y caiga el algodón; de igual forma que el tubo rotulado con la letra “T”.

• Se lavó cada material empleado para poder esterilizarlos nuevamente, así como se filtró y esterilizó más agua de mar reposada.

• Para cultivar en la botella:

1. Se realizó la limpieza y desinfección de la mesa de trabajo (empleando detergente, lejía y alcohol), aplicando lo aprendido anteriormente.
2. Se eliminó el contenido de la botella, teniendo cuidado de no contaminar por lo que realizada dicha acción de tapó inmediatamente con su propia tapa.
3. Se prendió el mechero bunsen para esterilizar el medio.
4. Se rotuló la botella (fecha, especie e integrantes, así como el grupo correspondiente).
5. Se hizo el tapón con el algodón, colocando el paliglobo en medio.
6. Se extrajo un litro y medio  de agua de mar esterilizada, se flameó el pico del vaso de precipitado, se adicionó a  la botella de 2 litros y se tapó.
7. Se desinfectó con alcohol la mesa de trabajo.
8. Se añadió a la botella 1,5 ml de nitratos; 1.5 ml de fosfatos; 1,5 ml de trazas de metales quelatados y 0,75 ml de vitaminas. Se mezclaron.
9. Se rotuló la botella de plástico de 2 litros (especie, integrantes y la fecha).
10. Se desinfectó con alcohol la mesa de trabajo.
11. Se cogió la botella de plástico y se sacó el tapón, el cual se colocó entre los dedos; a su vez se sacó el tapón del matraz de Erlenmeyer, se flameó su abertura en el mechero bunsen, se vertió un  poco (la mitad aproximadamente) a la botella. Acabado ello se prosiguió a tapar la botella y lo que quedó en el matraz se eliminó.
12. Se conectó la botella al aireador, verificando que las uniones estén correctamente, así como el ingreso del aire; procurando dejarla cerca al fluorescente (luminosidad).

• Para extracción de la muestra:

1. Se hirvió agua (jarra eléctrica).
2. Se colocaron los paliglobos en un recipiente y se le adicionó el agua caliente. Se dejó los paliglobos por unos minutos.
3. Se desinfectó la mesa con alcohol.
4. Se prendió el mechero de alcohol.
5. Se cogió el paliglobo y se le quitó el aireador a la botella.
6. Se sacó el tapón (procurando que no haga contacto con nada) e inmediatamente se introdujo el paliglobo pasando el medio de la botella; se tapó con el dedo el orificio del paliglobo, se sacó e inmediatamente se tapó la botella para evitar cualquier tipo de contaminación, el contenido del paliglobo se traslada al frasco, este se tapó y el paliglobo se eliminó al tacho de basura.
7. Se tapó el frasco y se volvió a colocar el aireador a la botella.
8. Se rotuló el frasco con la fecha, la especie e integrantes.
9. Se adicionó gotas de lugol con la pipeta pasteur (obteniendo un color anaranjado) para matar a las microalgas y de esta forma poder contarlas adecuadamente.

• Para realizar el conteo:

1. Se enjuagó la cámara de Neubauer y el cubre objeto.
2. Se secó el borde de la cámara de Neubauer con papel toalla y el centro con papel tisú.
3. Se secó el cubre objeto con papel tisú (para que no quede residuos).
4. Se colocó el cubre objeto encima de la cámara de Neubauer.
5. Se abrió el frasco y con la pipeta pasteur se sopló (provocando burbujas) y se absorbió un poquito e inmediatamente se trasladó a la cámara de Neubauer con el cubre objeto que se encontraban inclinados para que la gota se distribuya por toda la cámara.
6. Se verificó que toda la cámara se encuentre cubierta.
7. Se llevó al microscopio y se empezó con el conteo desde el 1er cuadrado hasta el noveno, considerando la “L” imaginaria  para evitar confusiones al contar, teniendo mayor exactitud.
8. Se anotaron los datos obtenidos.
9. Se repitió este procedimiento de conteo por 10 días (incluido el día cero).

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Resultados

En la Tabla 12 se presentan los resultados del conteo por cada día durante el periodo de 13 días de cultivo de la microalga Tetraselmis sp, así como su concentración y el log de la misma.

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