Guía Para Cromatografía
cambyck28 de Febrero de 2013
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UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA
ESCUELA DE QUIMICA
FACULTAD DE CIENCIAS
INSTRUMENTAL ANALITICO
GUIA DE CROMATOGRAFÍA
Caracas 2008
Tabla de Contenido
DEFINICIONES IMPORTANTES........................................................................................ 3
Cromatografía..................................................................................................................... 3
Clasificación de los Métodos Cromatograficos:................................................................. 3
Cromatograma: ................................................................................................................... 3
Tiempo de Retención..........................................................................................................4
Tiempo Muerto................................................................................................................... 4
ECUACIONES BASICAS EN CROMATOGRAFÍA...........................................................4
Constante de Distribución ..................................................................................................4
Factor de Capacidad ...........................................................................................................4
Factor de Selectividad ........................................................................................................5
Eficiencia de una Columna.................................................................................................5
Resolución de una Columna............................................................................................... 7
APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA................................................................... 8
Análisis Cualitativo ............................................................................................................ 8
Análisis Cuantitativo .......................................................................................................... 8
Calibración absoluta ....................................................................................................... 9
Método del estándar interno ........................................................................................... 9
Normalización de área..................................................................................................10
BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA.................................................................................. 11
DEFINICIONES IMPORTANTES
Cromatografía
La cromatografía es un método de separación de diferentes componentes de
una muestra, este método logra la separación de los mismos a través del paso
de una muestra por una fase estacionaria con la ayuda de la fase móvil, cada
componente de la muestra tiene propiedades particulares que permitirá su
interacción en forma diferente entre la fase estacionaria y móvil, de esta forma
cada componente se retrasa en forma particular y si el caudal, las característica
de la fase estacionaria y móvil y la longitud de la columna son las adecuadas
se lograra la separación completa de todos los componentes de la muestra.
El objetivo principal de un estudio cromatografía es lograr la separación de
todos los componentes en una muestra, para ello es necesario jugar con una
serie de factores cromatograficos, es por ello que es necesario conocer como
están relacionados los diferentes factores experimentales con las ecuaciones
cromatograficas.
Clasificación de los Métodos Cromatograficos:
Según como se coloque en contacto la fase móvil y estacionaria:
cromatografía en columna y cromatografía plana
Según el tipo de fase móvil utilizada: Cromatografía gaseosa y
cromatografía Liquida y cromatografía de fluidos súper críticos
Cromatograma:
Es la representación grafica de la señal en función del tiempo una vez que la
muestra es inyectada a un sistema cromatografico. Para obtener este
cromatograma a la salida de la columna se coloca un sistema de detección y
registro, que permite responder a una propiedad de la solución que contiene el
analito o del propio analito en función del tiempo, figura 1.
Figura 1.- Cromatógrama de dos componentes
Tiempo de Retención
El tiempo que transcurre después de la inyección de la muestra para que el pico del analito
alcance el detector se denomina tiempo de retención y se le da el símbolo tR. (ver figura 1)
Tiempo Muerto
Es el tiempo tM para que la especie no retenida alcance el detector (ver figura 1)
ECUACIONES BASICAS EN CROMATOGRAFÍA
Constante de Distribución
Los equilibrios de distribución implicados en cromatografía se describen por ecuaciones
simples que suponen la transferencia de un analito entre las fases estacionaria y móvil. Así
para una especie A
móvil estacionaria A ⇔ A
La constante de este equilibrio K se denomina, constante de distribución y se define como:
M
S
C
K = C ec. 1
donde CS es la concentración molar de analito en la fase estacionaria y CM es la
concentración molar de analito en la fase móvil.
Factor de Capacidad
Es un parámetro (k´) que se utiliza para describir las velocidades de migración de los
analitos en las columnas y se interpreta considerando que mientras mayor sea el valor de
este factor menor es la velocidad de migración de los solutos en la columna. Para una
especie A, el factor de capacidad A k′ se define como:
M
A S
A V
K V
k′ = ec. 2
donde KA es la constante de distribución, VS es el volumen de la fase estacionaria y VM es el
volumen de la fase móvil.
También puede ser descrito en términos experimentales los cuales pueden ser tomados de
un cromatograma:
( )
M
R A M
A t
t t
k
−
′ = ec. 3
donde (tR)A es el tiempo de retención del componente A y tM es el tiempo muerto obtenido
para una especie no retenida.
Factor de Selectividad
El factor de capacidad α de una columna, como su nombre lo indica, es un término que
define que tan selectiva es una columna para separar dos picos. Es de hacer notar, que la
columna puede ser selectiva a una separación, que se identifica por un valor alto de este
factor, pero si no se considera la mejora de los parámetros que pueden afectar el ancho de
un pico, aun así no se lograría la separación de los mismos.
Entonces el factor de selectividad de una columna para dos especies A y B se define como:
A
B
k
k
′
′
α = ec. 4
donde B k′ es el factor de capacidad del compuesto B, que es el mas retenido y A k′ es el factor
de capacidad del compuesto A, que es el menos retenido.
Con esta definición α siempre es mayor que la unidad.
En términos tomados a partir de un cromatograma α se puede calcular como sigue:
( )
( ) R A M
R B M
t t
t t
−
−
α = ec. 5
Eficiencia de una Columna.
Como se dijo anterior mente, si no se toma en cuenta los factores que afectan el ancho de
un pico para la separación cromatografía no se podría lograr una buena separación aun
cuando se tenga un factor de selectividad alto para estos picos en una columna particular.
Es decir que mientras mayor es la capacidad de la columna de producir picos mas estrechos
mayor es su eficiente.
La anchura de una banda aumenta a medida que se mueve a través de la columna, debido a
que cuanto más tiempo transcurre mayor es la dispersión que puede tener lugar. Por ello la
anchura de la zona está relacionada directamente con el tiempo de residencia en la
columna, e inversamente con la velocidad a la que fluye la fase móvil.
Se utilizan dos términos afines con frecuencia como medida cuantitativa de la eficacia de
una columna cromatográfica: (1) la altura equivalente de plato teórico o H y (2) el número
de platos teóricos N. Los dos están relacionados por la ecuación:
H
N = L ec. 6
donde L es la longitud (normalmente en centímetros) del relleno de la columna.
La eficacia de la columna cromatográfica aumenta cuando mayor es el número de platos, y
cuando menor es la altura de plato.
La evaluación experimental de H y N se puede realizar a partir de las siguientes ecuaciones:
2
2
16 R t
H = LW ec. 7
donde L es la longitud de la columna, W es el ancho del pico a considerar y tR es su tiempo
de retención.
2
16 ⎟⎠
⎞
⎜⎝
= ⎛
W
N tR ec. 8
Para tener una mejor idea de cómo afectan las diferencias variables cromatográficas el
ancho de un pico, que a se vez, se traduce en la modificación de la eficacia de una columna
Van Deemter presentó la siguiente ecuación:
H = A + B /u + Cu ec. 9
En esta ecuación se evalúan varios términos que pueden contribuir al ensanchamiento de
una banda los cuales se pueden interpretar como sigue:
El termino A, igual a p 2λd y atribuido a la difusión en remolino, representa el efecto de
trayecto múltiple de
...