IDENTIFICACION BACTERIANA

TEMA:

Identificación Bacteriana

OBJETIVO:

Conocer las medidas de Bioseguridad y manejo de equipos.

INTRODUCCIÓN

TINCIÓN DIFERENCIAL

Fundamentos de diferenciación de Gram positivo y Gram negativo. Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas. La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa depeptidoglucano, además de dos clases de ácidos teicoicos: Anclado en la carainterna de la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra elácido lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está ancladosolamente en el peptidoglucano (también conocido como mureína)Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada,y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (decomposición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido.Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estasdiferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que esel material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristalvioleta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el contrario, las Grampositivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporciónde peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sinoque este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que puedaescaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea.Bacterias Escherichia coli vistas al microscopio tras ser teñidas con la tinciónde Gram.

MATERIALES

• Microscopio

• Caja Petri

• Porta y cubre objetos

• Violeta de Cristal

• Lugol

• Alcohol Cetona

• Sofranina

• Asa de siembra

• Gotero

• Aceite de inmersión

¿Cómo realizar el enfoque?

El enfoque se realiza en el primer paso colocando adecuadamente el cubre objetos sobre el porta objetos y luego añadiento el aceite de inmersión para concentrar la luz. El portaobjetos debe colocarse en las pinzas del microscopio y se puede acomodar la platina para colocar bien el foco.

En este microscopio existe un manilla "macro" de desplazamiento brusco, para aproximar el enfoque, y uno, llamado "micro", para ajustarlo. Primero utilizamos el macro para bajar el lente y luego seguimos con el micro hasta conseguir enfocar correctamente el plano de foco.

Mirando por fuera del microscopio se lleva el objetivo junto a la preparación y mirando luego por el ocular se va separando lentamente hasta obtener la imagen.

¿Cómo se realiza la Tinsión diferencial?

La coloración o tinsión se la realiza de la siguiente manera:

• 1 minuto en cristal violeta de Hucker (colorante inicial) y se lava con agua destilada.

• 1 minuto en lugol

• Se decolora con alcohol de 95° (decolorante) y se lava con agua destilada.

• 1 minuto en Sofranina (colorante de contraste) se lava con agua.

• Se seca suavemente y sin frotar con papel toalla.

Una vez que la preparación está totalmente seca, poner una gota muy pequeña de aceite de inmersión y observar al microscopio con el objetivo.

METOLOGÍA

En un portaobjetos bien limpio (con alcohol, papel de filtro y flameado) se coloca una gota de agua destilada a la que con el asa de siembra, previamente esterilizada a la llama, se lleva una pequeña cantidad de suspensión de bacterias o, en su caso, de una colonia( la que nos de el profesor).

Con el asa se extiende la gota y las bacterias sobre el portaobjetos y se fija la extensión por el calor, calentando suavemente a la llama del mechero hasta que se seque, aquí se realiza la llamada fijación mediante calor.

Posteriormente se realiza la coloración de la siguiente manera:

• Primero se coloca en el portaobjetos la Violeta cristal (Tiñe todas las baterías, gram + y -) 1´ y enjuagamos de manera que el agua no caiga directamente sobre la muestra y asi en todas los colorantes.

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