INGENIERIA DE GENOMAS- Resumen BCA.

Resumen BCA.

INGENIERIA DE GENOMAS- teoría n°7

¿Que es? →  procesos que permitan realizar modificaciones en el genoma: deleciones, inserciones o modificaciones en la secuencia de ADN.

¿Para que?

• Dilucidar la función de genes específicos y de elementos regulatorios.
•  Corregir/Reemplazar genes defectuosos responsables de algún tipo de trastorno o desorden metabólico, asociados a enfermedades (terapia génica)
•  Aprovechar las características de un locus en el genoma (previamente caracterizado y seleccionado) debido a su capacidad de mantener la expresión de un TG en forma elevada y estable en el tiempo (hotspot)

Conceptos básicos

Ruptura de la doble hélice de ADN [ DSB = Double strand break]

 Se produce debido a la presencia de diferentes agentes físicos y químicos, o debido a estrés mecánico que puedan sufrir los cromosomas. Cuando una ADN polimerasa encuentra una hebra del ADN dañada, produce el DSB para permitir que de este modo se desencadene el mecanismo de reparación.

 Por otra parte, existen enzimas capaces de causar DSB, como por ejemplo: FokI.

Maquinaria de reparación del ADN endógena:

• Unión de extremos no homólogos
• Reparación dirigida por homología

Metodologías para la Ingeniería de Genomas: OBJETIVO

• Introducir la modificación deseada en el genoma de gran parte de la población
• Evitar mutaciones “off-target”
• Permitir la síntesis y ensamblaje de nucleasas específicas en un determinado sitio del genoma de manera rápida, eficiente y a bajo costo.

DIVERSAS METODOLOGIAS:

1. Recombinación sitio especifica(SSR): Enz. Recombinasas

Identificado durante la mitosis o meiosis. Es un tipo de recombinación genética que ocurre entre dos secuencias de ADN que presentan cierto grado de homología.( Crossing over de cromosomas).

Recombinasas (sitio especif.) →Reconocen y se unen a secuencias específicas de ADN causando su ruptura, posterior intercambio de ambas hélices y finalmente ligación.

Catalizan diferentes reacciones:

• Inversión : Se produce un cambio en la orientación del TG.(corte + cambio de orientación)
• Traslocacion : Se produce la translocación de los transgenes.(corte y trasloque)
• Integración-excision: Se produce la eliminación del transgen. El procedimiento de inserción ocurre con menor frecuencia(inestable, se integra-condenza una secuencia y se elimina una parte de ella)
• Intercambio de casette: Se produce la integración del gen de interés (GOI) en el genoma celular, de manera específica.(reemplazo por una secuencia de mi interés). Excisión de un segmento de ADN mediado por una recombinasa y posterior integración del cassette de expresión rodeado por los mismos sitios de recombinación presentes en el genoma. Los sitios de recombinación heterólogos son incapaces de interactuar entre sí, impidiendo reacciones cruzadas y permitiendo la integración del GOI en la orientación correcta. Es fundamental la incorporación de una sola copia del transgen en el genoma celular. De este modo se evitarán grandes re arreglos en el genoma que pueden conducir a la muerte celular.

Ventajas:

El targeting de un clon previamente caracterizado resulta ser una metodología rápida, eficiente y precisa. Además las propiedades de expresión de las nuevas líneas celulares a obtener son predecibles.

Desventajas :

Integración al azar

Genotoxicidad( por inducción de activ. Endonucleolitica y toxicidad)

En el tp  lo vemos prácticamente , haciendo un intercambio en clones HEK  que expresan GTP(fluorescencia verde) por un casette de flouorescencia roja (transfeccion)

1. Zinc finger y TALE Nucleasas: enzimas capaces de causar DSB

 Posees un dominio catalítico (nucleasa)  capaz de digerir secuencias de ADN de manera inespecífica. La enzima más empleada empleada es FokI. La especificidad de reconocimiento esta dada por proteínas ZFN o TALE, capaces de reconocer específicamente secuencias de ADN genómico.

FokI

Es capaz de digerir secuencias de ADN entre 9 y 13 nts hacia abajo del sitio de reconocimiento. Es activa solamente cuando se encuentra como homodímero: por este motivo se debe fusionar un monómero a cada proteína que reconozca hebras de ADN complementarias. De este modo podrá inducir el DSB

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