Informe Marcadores Moleculares

Universidad San Francisco de Quito                                                             [pic 1]

Laboratorio de Ingeniería Genética

Informe N 3

Nombres y Apellidos: Mishell Alvarez Arcos

Código: 00125325                                                                 Sección: I

Fecha de entrega: 25/02/2019                                                     Nota: __________________ 

TÍTULO: Extracción del gen GFP a partir del plásmido mediante amplificación, preparación del medio de cultivo y ligación del gen GFP mediante el vector pGEM-T y transformación de bacterias con ADN recombinante.

1. Introducción

La proteína fluorescente verde (GFP) es una herramienta para visualizar los patrones espaciales y temporales de la expresión génica in vivo. La fuente del gen GFP es la medusa bioluminiscente Aequorea victoria, se utiliza ampliamente como gen reportero para los procesos de transformación bacteriana, por ello es necesario obtener el gen mediante un plásmido clonado, el cual puede generarse por dos vías: Amplificación cuando existe una pequeña cantidad de ADN o enzimas de restricción, ya que tienen la capacidad de cortar secuencias determinadas y/o especificas (:………….). En la práctica se utilizó el plásmido EHA 402 de la bacteriana Agrobacterium tumefaciens que contiene el gen GFP.

Después el gen de interés debe ser clonado por un vector, el cual debe tener tres características: Sitio de restricción, origen de replicación y un gen de selección (………..). El vector pGEM-T es de clonación, su tamaño es pequeño, tiene la capacidad de ligar pequeños fragmentos de ADN por la conformación en su terminal 3´, para el proceso de unión de los fagmentos se emplea la T4 ADN ligasa porque promueve la formación de los enlaces covalentes (………).

La transformación bacteriana se define como la capacidad de captar o introducir ADN exógeno a las células, es un proceso que se da en forma natural, sin embargo, no todos los organismos presentan la capacidad para realizarlo, por ende, se requieren métodos sintéticos, es necesario la inducción de la “competencia”, el método más convencional implica el tratamiento con CaCl2 seguido de un choque térmico para lograr la transformación. También se emplean métodos de alta gama orientados a dispositivos como la electroporación o la transformación mediada por ultrasonidos, con los métodos se crean pequeños poros en las células bacterianas para que el ADN exógeno ingrese (………………).

Para el procedimiento se emplea colonias bacterias de E.coli que tienen la capacidad de incorporar el ADN a las células y pueden expresar un plásmido que contiene dos genes: un gen codifica una proteína verde fluorescente (GFP) y el otro codifica la resistencia a la ampicilina (………….).  El gen de resistencia a la ampicilina nos permite seleccionar cuál de las células de E. coli se han transformado en función de su capacidad para crecer en un medio selectivo que contiene el antibiótico (………..).Para verificar la transformación  bacteriana, el gen de resistencia a la ampicilina debe estar  presente, dirige la producción de una enzima que bloquea la acción de la ampicilina, y las bacterias pueden sobrevivir. Las bacterias sin el plásmido y, por lo tanto, el gen de resistencia no puede crecer en una placa o medio de cultivo que contiene ampicilina, y solo las células transformantes sobrevivirán (:……………).

Las aplicaciones de la transformación bacteriana son: hacer múltiples copias de ADN denominado clonación de ADN, para producir grandes cantidades de proteínas humanas específicas y modificación genética de una bacteria u otra célula (:……….).

1. Objetivos

• Extraer el gen GFP a través del plásmido 402 de Agrobacterium tumefaciens mediante el proceso de amplificación.
• Preparar un medio de cultivo para la identificación de células recombinantes, las cuales son el resultado de la ligación de un fragmento del gen GFP con el vector pGEM-T, transformadas en células de E. coli.
• Inducir la competencia en las cepas DH10-B en las bacterias de E.coli empleando la técnica del shock térmico con cloruro de calcio.

1. Materiales

Parte 3a

• Plásmido 402
• Primer forward
• Primer reverse
• Reactivos para PCR
• Termociclador
• Juego de micropipetas
• Puntas de micropipetas
• Tubos eppendorf

Parte 3b

• Medio de cultivo Mcconkey lactosa
• Antibiótico ampicilina
• Agua destilada
• Micropipetas
• Cajas de plástico desechables
• Erlenmeyers de 500 ml
• Microondas
• Autoclave
• Cámara de flujo laminar
• Para flim

Parte 4

Ligación

• Vector pGEM-T
• Producto PCR (Gen GFP)
• T4 Ligasa
• Agua libre de endonucleasas
• 2X Buffer de ligación para T4 ADN ligasa
• Estufa a 37 C
• Tubos eppendorf
• Micropipetas

Transformación

• Caldo de células jóvenes de E. coli DH10-B
• Solución de cloruro de calcio 60 Mm
• Medio de cultivo LB líquido
• Hielo
• Microcentrífuga
• Baño maría a 42 C
• Estufa a 37 C
• Cajas con medio Macconkey  + amp 50 ug/ml
• Tubos eppendorf
• Micropipetas
• Parafilm

1. Metodología

Parte 3 a

Se realizó los cálculos para el mix de PCR para cuatro reacciones, se agregó lo siguiente: 52,8 µl de agua, 8 µl de buffer (10X), 3.2 µl de MgCl2 (50mM) y dNTPS (10mM), 4 µl  de primer forward (10 uM) y Primer reverse (10uM), 0.8 µl de taq polimerasa (5U/µl) y 1 µl de ADN, se procedió añadir los componentes del master mix y se colocó en tubos de PCR, se añadió ADN a cada tubo, luego se procedió a poner los tubos en un termoreciclador y se corrió en el siguiente programa de amplificación : en la denaturación  inicial a 94 ºC durante 2 minutos, el proceso de denaturación a 94 ºC por 15 s, el annealing a 57 ºC durante 30 s, extensión a 68 ºC durante 45 , todos los pasos se realizaron s a 35X y la extensión final a una temperatura de 68 ºC por 10 minutos, luego se realizó una electroforesis en un gel de agarosa al 1% y se analizó el gel.

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