La producción de metabolitos recombinantes

1. Introducción artículo

La producción de metabolitos recombinantes es una de las aportaciones más importantes de la biotecnología moderna. El hospedero bacteriano más importante para la producción es Escherichia coli, aunque otros como Bacillus subtilis y Bacillus megaterium están cobrando cada vez más importancia. Debido a su impacto económico y en el sector de la salud humana.

Los polisacáridos microbianos se han utilizado ampliamente en las industrias alimentaria, cosmética, petrolera y médica para modificar las propiedades funcionales o la textura de los productos existentes. Sanxan es un nuevo polisacárido producido por Sphingomonas sanxanigenens NX02 (DSM 19645).

La estructura de sanxan es diferente a la de otros polisacáridos microbianos, como xanthan, gellan, welan y diutan (Schmid, Sperl y Sieber, 2014). La estructura única del hidrogel transparente purificado sanxan le otorga una estructura de microred especial y propiedades funcionales, como el carácter de gelificación, alta transmisión de luz y capacidad de formación y estabilización de emulsiones, lo que lo convierte en una alternativa prometedora para su uso en alimentos, cosméticos, aplicaciones médicas y farmacéuticas (Wu et al., 2017b). El crudo sanxan (total precipitable material, TPM) también tiene amplio uso en la recuperación de petróleo por inundación de agua y en la construcción de industrias (Huang et al., 2009b). Sanxan se ha utilizado en China durante años como lodo de perforación y como agente espesante en la recuperación de petróleo mediante inundación con agua (Huang et al., 2013). Recientemente, se ha identificado la ruta biosintética de sanxan.

Además, S. sanxanigenens NX02 puede acumular poli(R-3-hidroxibutirato) (PHB), un termoplástico microbiano intracelular, como compuesto de almacenamiento de carbono y energía en muchas bacterias y algunas arqueas.

1. Método (Construcción de plásmidos, método de transferencia de conjugación) Grace

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Cepas utilizadas:

Sphingomonas sanxanigenens NX02 (DSM 19645), un productor de polímero sanxan (tipo salvaje/Wilde type).

Escherichia coli S17 funcionó como donante en la transferencia conyugal.

Vector suicida pLO3 sirvió como herramienta knock-out.

Se cultivaron cepas de E. coli S17 portadoras de diferentes vectores en medio Luria Bertani a 37°C, Sanxanigenens NX02 se cultivó a 30 °C en medio NK más glucosa y medio YEME (extracto de levadura, extracto de malta) (eLabProtocols, 2020) que se desarrolló para reducir la producción de polisacáridos y mejorar la suspensión celular. Y los antibióticos se utilizaron en las siguientes concentraciones (ÿg/mL): tetraciclina (Tc; 10) y cloranfenicol (Cm; 25).

Manipulación de ADN:

1. Los genes diana se inactivaron mediante recombinación homóloga de doble cruzamiento.

La recombinación homóloga es un tipo de recombinación genética en la que se intercambian secuencias de nucléotidos entre dos moléculas parecidas o idénticas de ADN.

1. Las secuencias flanqueantes upstream y downstream son de 15kb aprox. Y se empalmaron mediante PCR de extensión superpuesta: OE-PCR ) es una variante de la PCR . También se conoce como empalme por extensión de superposición / empalme por extensión de voladizo (SOE) PCR . Se utiliza para insertar mutaciones específicas en puntos específicos de una secuencia o para empalmar fragmentos de ADN más pequeños en un polinucleótido más grande. 
2. Los cebadores, usados para amplificar los fragmentos flanqueantes de los genes diana, contenían sitios de restricción Sac I, Xba I o Pac I
3. Los productos de PCR de los genes respectivos se digirieron con las enzimas de restricción apropiadas, se ligaron en pLO3 y se usaron para transformar E. coli S17. En este proceso, los investigadores aplicaron un método de eliminación de genes sin marcadores para llevar a cabo múltiples eliminaciones de genes en una sola cepa

Construcción de plásmidos:

El genoma de S. sanxanigenens NX02 se extrajo con un kit de minipreparación de ADN genómico bacteriano AxyPreP™.

El ADN del plásmido se purificó de E. coli utilizando el kit Axyprep™.

Los productos de PCR se purificaron utilizando el kit de extracción de gel de ADN (Axygen) o el kit de limpieza de PCR (Axygen).

Método de transferencia de conjugación:

1. Los plásmidos recombinantes suicidas se transfirieron de E. coli S17 a la cepa de tipo salvaje S. sanxanigenens NX02, utilizando un filtro biparental de apareamiento a 30 °C durante 12 h en medio NKG sin antibióticos
2. Los mutantes de cruce único se seleccionaron en medio NKG que contenía 10 ÿg/mL de Tc y 25 ÿg/mL de Cm, y luego se recubrieron en medio NKS con 25 ÿg/mL de Cm
3. Finalmente se usó PCR para detectar cepas deficientes en el gen diana utilizando los cebadores de verificación.

[pic 2]

1. Método (mutanogénesis en plasma, fermentación por lotes, extracción del polímero

• Mutagénesis en plasma

Pasos previos

1. La cepa deficiente en PHB se precultivó hasta una densidad celular de ~10 5 /ml.
2. Se depositaron gotas de la suspensión bacteriana en el fondo del muestreador en el banco limpio.
3. Se mantuvo a temperatura ambiente durante unos 10 min para formar una membrana bacteriana.

Mutagénesis

1. Se empleó el instrumento MPMS que se había esterilizado con UV durante 30 min.
2. Se fijó la tasa de flujo de gas N2 en 12 slm (litro estándar por minuto).
3. El plasma se introdujo en la célula con el flujo de gas y se realizó una mutagénesis en gradiente de acuerdo con diferentes períodos de tiempo (30 s–180 s).
4. Las células se resuspendieron en 1 mL de medio NKG nuevo y luego el gradiente diluido.
5. Se incubó a 30 °C durante 3 días

• Fermentación por lotes

1. Se empleó un biorreactor autoclavable de 5L que contenía 3L de medio.
2. La temperatura y el pH se mantuvieron a 30 °C y 7, respectivamente.
3. La concentración de oxígeno disuelto (OD) se fijó por encima del 50 % de saturación de aire, ajustando la velocidad de agitación y la tasa de aireación.  
4. Después de 60 h de fermentación el caldo de fermentación se volvió demasiado viscoso para disolver el oxígeno.

• Extracción del polímero

1. EL caldo de fermentación se diluyó 5 veces con agua desionizada
2. Se calentó a 90–100 °C durante 10 min
3. Se centrifugó a 12,000g por 20 min
4. Se filtró por succión para separar el sobrenadante y el sedimento celular.
5. Se recogió el sobrenadante transparente y se ajustó el pH a 3,0 para precipitar el polímero sanxan
6. El polímero sanxan precipitado se dializó frente a agua desionizada hasta la neutralidad
7. Sanxan y el sedimento celular se secaron hasta un peso constante a 60 °C.
8. Se midió el rendimiento del polímero sanxan purificado y el peso seco
9. Se midió con un viscosímetro una velocidad de corte de 60 rpm

1. Resultados obtenidos (Mutagénesis en plasma en la cepa deficiente en PHB para mejorar la producción de sanxan,

Se demostró que la mutagénesis plasmática es una mutagénesis prometedora por su alta frecuencia de mutación, amplio espectro de mutación y relativamente poco daño a la célula

La mutagénesis en plasma se realizó en la cepa NX02-dPHB. A través de la comparación del tamaño de las colonias, se seleccionaron algunas colonias más grandes (el diámetro era de aproximadamente 0,5 ± 0,1 cm, 5 a 7 veces más grande que NX02-dPHB) para la fermentación adicional.

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