USO DE LA BACTERIA E. COLI PARA LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES

USO DE LA BACTERIA E. COLI PARA LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES

Delegado Bernedo, Juan Miguel.

Reátegui Ríos, Grazia Valeria

Vera Coila, Desyree Raziel; Universidad Católica de Santa María.

RESUMEN:

Diversos biofármacos basados en proteínas recombinantes son producidos en la actualidad por la industria biofarmacéutica. Los sistemas de expresión para la obtención de biofármacos, se basan en vectores que permiten la clonación del gen que codifica la proteína de interés en una célula hospedera como bacterias, levaduras y líneas celulares. Diversos biofármacos como factores de coagulación, hormonas, citocinas y enzimas han sido aprobados para su distribución comercial. La demanda creciente de medicamentos para el tratamiento de enfermedades, está impulsando el desarrollo de biotecnologías para la producción sustentable de biofármacos inocuos, efectivos y de costo razonable.  En este trabajo se observó que a temperaturas inferiores de 37ºC, cI857 impide el inicio de la transcripción por la ARN polimerasa y no habrá producción de la proteína; sin embargo, una vez que la temperatura se aumenta, inicia la transcripción del gen y más tarde la bacteria sintetizará la proteína. Los resultados indican que, mientras se producía la PPIH, se observó que las temperaturas de 32 ºC y 42 ºC favorecen la agregación de la misma en “cuerpos de inclusión” (hasta un 33%).

PALABRAS CLAVE: Transcripción, proteínas recombinantes, gen, cuerpos de inclusión, síntesis, E. Coli.

SUMMARY:

Several biopharmaceutical products based on recombinant proteins are manufactured at present by biopharmaceutical industry. Expression systems to obtain biopharmaceuticals are based on cloning vectors of genes coding for the protein of interest into a suitable host cell such as bacteria, yeast and cellular lines derived from mammals. Several biopharmaceuticals such as clotting factors, hormones, cytokines and enzymes have been approved for their commercial distribution. Growing demand of medicines intended for the treatment of infectious and chronic diseases is impelling the development of new biotechnologies focused on the ecological production of harmless, efficient and fair cost biopharmaceuticals. It was seen that at temperatures below 37°C, cl857 prevents the beginning of the transcription by the RNA polymerase and the production of the protein will not occur; however once the temperature increases, begins the transcription of the gen and in consequence the bacteria will synthetize the protein. The results show that while preproinsulin was produced, the temperatures between 32°C and 42°C favour the aggregation of the same in “inclusion bodies” (up to 30%)

INTRODUCCIÓN:

Desde el inicio de la biotecnología moderna en los 70s, la bacteria Escherichia coli ha sido empleada para la producción de proteínas recombinantes, debido entre otras características, a su alta velocidad de crecimiento y a la fácil operación de cultivos de alta densidad celular que se logran con ella. Los elementos que se requieren para producir dichas proteínas son: el organismo hospedero (que es la bacteria) y un plásmido o secuencia de ADN (que está formado por varios segmentos: origen de replicación, gen de interés, promotor del gen de interés, gen de selección, etc.), por medio del cual se introduce en la bacteria el gen que lleva la información de la proteína terapéutica y con características que permiten a la maquinaria de la bacteria producirla. Ya que el plásmido contiene el gen que codifica para la proteína de interés, al colocar a la bacteria en las condiciones de cultivo apropiadas, obtendremos la proteína recombinante deseada (proteína de un determinado organismo que, por métodos de ingeniería genética, puede expresarse en otro). (1)

La bacteria Escherichia coli (E. coli) es ampliamente utilizada en la industria biotecnológica para la producción de proteínas recombinantes con fines diagnósticos, terapéuticos o vacunales, por procedimientos relativamente baratos, ya que ha sido muy bien caracterizada desde el punto de vista genético y fisiológico. Es un bacilo corto gramnegativo que se localiza en las heces fecales; habita en el conducto intestinal normal del hombre y de los animales y en algunos casos puede ocasionar enfermedades como: hepatitis, septicemia, cistitis y otras. (2)

La producción de proteínas recombinantes (PR) es una de las aportaciones más importantes de la biotecnología moderna. El hospedero bacteriano más importante para la producción de PR es Escherichia, debido a su impacto económico y en el sector de la salud humana. (3)

Las proteínas recombinantes son producidas en sistemas heterólogos in-vitro mediante tecnología de ADN recombinante se obtienen a partir de organismos vivos, los organismos hospedadores, en los que se ha introducido material genético procedente de otro organismo mediante técnicas de ADN recombinante, de tal manera que el organismo hospedador o huésped, emplea su maquinaria biológica para producir la proteína cuya secuencia está codificada en el ADN introducido artificialmente. Actualmente, se desarrollan nuevos y mejores sistemas de expresión, implementando nuevos plásmidos, adición de elementos genéticos del gen adicional y optimización de codones. (4)

EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN ESCHERICHIA COLI

Entre los parámetros más importantes en la producción exitosa de proteínas recombinantes en E. coli se encuentran: la eficiencia transcripcional y traduccional, la estabilidad del vector de expresión y de los ácidos ribonucleicos (ARN) transcriptos, la estabilidad de las moléculas ante el ambiente proteolítico del hospedero y la localización y plegamiento de la proteína. (3)

Dentro de los sistemas procariotas, uno de los modelos de expresión más utilizados ha sido Escherichia coli. El éxito de esta se basa principalmente en: (5)

• La facilidad de manipulación del DNA.
• El elevado número de mutantes y vectores de expresión disponibles.
• El amplio conocimiento de la fisiología de la célula, que permite alcanzar densidades celulares elevadas con un medio de cultivo económico.
• El conocimiento del efecto de la sobreexpresión de proteínas sobre la bacteria. (5)

Sin embargo, Escherichia coli presenta ciertos inconvenientes en la síntesis de proteínas recombinantes: (5)

• No lleva a cabo procesamientos post-transduccionales propios de células eucariotas, como es el caso de la glicosilación o fosforilación, lo cual afecta a la estructura, estabilidad, solubilidad y actividad biológica de la proteína producida.
• Carece de chaperonas (proteínas de plegamiento) adecuadas para permitir un plegamiento correcto de las proteínas recombinantes.
• No forma puentes disulfuro en el citoplasma, salvo en ciertas cepas mutantes. (5)

Aspectos inherentes al diseño de biorreactores, así como limitaciones operativas relacionadas a los subprocesos de transferencia de calor, ocasionan que la tasa de incremento de temperatura en fermentadores de gran escala sea substancialmente menor que en sistemas de nivel laboratorio. Este fenómeno puede afectar el escalamiento ascendente de cultivos de E. coli recombinante en donde la proteína heteróloga es termoinducida, ya que diferencias en el aumento de la temperatura pueden tener efectos diferentes sobre las respuestas de choque térmico y astringente en relación a la sobre expresión del producto de interés.  (7)

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