MEtodos De Estudio De Proteinas

Separación de proteínas

La enorme complejidad (varios miles de proteínas diferentes) del proteoma de la mayor parte de los organismos vivos obliga al empleo de diversas técnicas para separar las proteínas. Entre las técnicas más comunes se encuentran la electroforesis mono y bidimensional así como la cromatografía líquida en sus distintas variantes.

La técnica más extendida es la electroforesis en geles de poliacrilamida (llamada SDS-PAGE por sus siglas en inglés "Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis"). Se trata de una electroforesis en gel de poliacrilamida al que se le añade el detergente dodecilsulfato sódico con el fin de desnaturalizar las proteínas, asegurar que todas se encuentren cargadas y por tanto puedan migrar en un campo eléctrico en función de su masa molecular relativa (Mr). Una variante de este tipo de electroforesis es la electroforesis bidimensional o 2D-PAGE, en la que el fraccionamiento en geles SDS-PAGE es precedido por una separación basada en el punto isoeléctrico de las proteínas. La electroforesis 2D-PAGE permite alcanzar una mayor resolución y es por tanto utilizada en el análisis de proteomas muy complejos. Una vez realizado el fraccionamiento, distintos métodos de tinción (Azul Coomassie, tinción de plata, tinción Sypro Rubi, etc) permiten visualizar las proteínas separadas. La cromatografía líquida también se emplea en el fraccionamiento y separación de proteomas complejos. Las distintas variantes existentes permiten separar las proteínas en función de su hidrofobicidad (cromatografía de fase reversa), carga eléctrica (cromatografía de intercambio catiónico/aniónico) y tamaño (cromatografía de exclusión molecular).

Electroforesis

La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico.1 La separación puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte sólido (p. ej., electroforesis en papel o en acetato de celulosa), o bien a través de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolución (electroforesis libre). Dependiendo de la técnica que se use, la separación obedece en distinta medida a la carga eléctrica de las moléculas y a su masa.

(El gel corre hacia una dirección sobre un gradiente de pH bajo una condición de no desnaturalizante para separar las proteínas por puntos isoeléctricos 2 (pl)y luego en una dimensión ortogonal bajo una condición de desnaturalización para separar las proteínas por sus pesos moleculares (MW). Posteriormente sigue un proceso de tinción que por lo general es de color plata, que es muy sensible, para revelar las posición de todas las proteínas.)

La electroforesis se usa en una gran mayoría en la materia del ADN recombinante ya que nos permite saber la carga que poseen los polipéptidos, y separar los diferentes polipeptidos resultantes de las variaciones del experimento del ADN recombinante. La variante de uso más común para el análisis de mezclas de proteínas o de ácidos nucleicos utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo, mientras que las proteínas se cargan al unirse con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente de la masa molecular de la proteína. Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando por la malla del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas), por lo que las pequeñas se moverán mejor, más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida.

Velocidad molécula

Para separar distintas especies moleculares, se crea un campo eléctrico para la molécula colocada en un líquido portador. Al generar este campo existirá una intensidad pasando constantemente del polo positivo al polo negativo, por lo tanto, actuará una fuerza sobre la molécula y esta experimentará una aceleración hasta obtener una velocidad en la que la resistencia, por viscosidad del medio, neutraliza la fuerza impulsora, es decir, la molécula se desplaza con una velocidad constante.

Donde q es carga y E es la intensidad del campo eléctrico.

Se asume que la partícula es esférica y a partir de la Ley de Stokes se obtiene que

donde R es el radio de la esfera, ν su velocidad y η la viscosidad del fluido.

Por lo tanto la velocidad será:

Esta velocidad se alcanza a los pocos segundos, por consiguiente se puede concluir que es constante durante todo el experimento

Movilidad molecular

La movilidad molecular ( ) es una magnitud característica de la partícula o molécula que refleja la velocidad relativa a la fuerza del campo.

A partir de la ecuación de velocidad se obtiene que:

Que también puede ser expresada por:

Donde el número de electrones y es la carga del electrón.

La movilidad depende de la carga de la partícula que, a su vez, depende del pH del medio en el que se encuentre. Por esta razón es necesario indicar el electrolito o el pH utilizado para determinar la movilidad.

Degradación de Edman

La degradación de Edman, desarrollada por Pehr Edman, es un método de secuenciación de aminoácidos en un

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