MICROSCOPÍA

Microscopía

Las células son estructuras muy pequeñas que se encuentran fuera del alcance de nuestra vista humana. Por eso, al ser en este tema nuestro objeto de estudio, ha sido necesario a lo largo de la Historia el desarrollo de instrumentos, métodos y tecnologías que permitan la observación de las mismas. Podemos definir miscroscopía como el conjunto de técnicas y métodos destinados a hacer visible los objetos de estudio que por su pequeñez están fuera del rango de resolución del ojo normal . La resolución aproximada del ojo humano es de 0.2mm o 200 µm. Esto quiere decir que es la menor distancia que puede distinguir.

Amplificación

Los microscopios están formados por dos lentes convergentes:

Una lente objetivo que se encuentra situada muy cerca del objeto a observar.

Una lente ocular encontrada al otro extremo del tubo, situada más cerca del ojo, tiene mayor longitud de distancia focal y menor amplificación.

La amplificación de un microscopio es el producto de número de aumentos del objetivo por los del ocular. Los componentes de un microscopio son:

-Fuente luminosa que ilumina la muestra

-Condensador que enfoca los rayos de luz sobre la muestra

-Platina sobre la cual se coloca la muestra

-Objetivo que recibe la luz que atravesó la muestra

-Ocular que recibe directamente la imagen formada por el objetivo

Poder de resolución

El poder de resolución puede definirse en términos de la capacidad para ver dos puntos vecinos en el campo visual como dos entidades distintas; dicho poder está limitado por la longitud de onda de la iluminación de acuerdo con la ecuación:

d=0.61λ/(n sen α)

Donde d es la distancia mínima que debe separar dos puntos en la muestra para resolverse, lambda (λ ) es la longitud de onda de la luz y n es el índice refractivo del medio presente entre la muestra y la lente del objetivo . Alfa (α ) es igual a la mitad del ángulo del cono de luz que entra a la lente del objetivo. Alfa es una medida de capacidad de reunión de luz de la lente y mantiene una relación directa con su abertura.

El denominador de la ecuación se conoce como abertura numérica (N.A.). Es una constante para cada lente, una medida de sus calidades para reunir luz.

Microscopio fotónico

Campo claro

En campo claro toda la luz desde el espécimen y sus alrededores es colectada por el objetivo para formar una imagen contra un fondo brillante.

El campo claro es la forma más simple de microscopía donde la luz pasa a través de o reflejada del espécimen. La iluminación no se altera por aditamentos que cambien las propiedades de la luz (como polarizadores o filtros).

En aplicaciones biológicas, las observaciones de campo claro son usadas ampliamente para tinciones o pigmentos naturales o especímenes altamente contrastados montados en un porta objetos. El espécimen es iluminado desde abajo y observado desde arriba. El espécimen aparece brillante, pero más oscuro que el brillante fondo. Esta técnica es ampliamente usada en patología para ver secciones de tejidos fijos o películas celulares/frotis. El campo claro no es muy útil para células vivas sin teñir o secciones de tejido sin teñir, como en la mayoría de los casos, la luz pasa a través de muestras transparentes o traslucida con poca o sin definición de la estructura.

Las estructuras (células, microorganismos, etc.) aparecen iluminadas sobre un fondo, también iluminado.

Todos los microscopios son capaces de obtener imágenes de campo claro.

Contraste de fases

La microscopia de contraste de fases es una técnica óptica que explota los cambios en el índice de refracción para producir imágenes de alto contraste de especímenes transparentes.

En las imágenes de contraste, los pequeños cambios en la longitud del camino óptico (conforme la luz se mueve a través de materiales diferentes de diferentes índices de refracción, por ejemplo, agua, componentes celulares) son trasladados ópticamente dentro de los cambios correspondientes en la intensidad de la luz, los cuales pueden ser observados como diferencias en los contrastes de la imagen.

La luz desde una lámpara de halógeno-tungsteno es dirigida a través de un lente colector y enfocada en anillos especializados posicionados en el condensador. Los frentes de onda pasando a través del anillo iluminan al espécimen y pasan directamente a través de estos o son difractados y retardados por los gradientes de fase en el espécimen. La luz sin desviar y difracta colectada por el objetivo es separada por un plato de fases y enfocada en el plano intermedio de la imagen para formar la imagen final. Un desventaja de las imágenes de contraste de fases es la ocurrencia de “halos” alrededor de las áreas de alto desplazamiento de fases.

La imagen de contraste de fases es aplicable a varios objetos transparentes, como células vivas en cultivos, micro-organismo, rebanadas delgadas de tejido, patrones litográficos, vibras, dispersiones de látex, fragmentos de vidrio, y partículas subcelulares (incluyendo núcleos y otros organelos) donde la técnica revela estructuras que no son visibles en campo claro. Una ventaja de la microscopia de contraste de fases es que las células vivas pueden ser observadas en detalle sin la necesidad de teñirlas o usar fluoróforos.

La capacidad de contraste de fases se puede agregar a casi cualquier microscopio de campo claro, utilizando los objetivos de contraste de fases especializados que se conformen a los parámetros de longitud de tubo y un condensador que acepte anillos de fase del tamaño correcto.

Campo Oscuro

La microscopia de campo oscuro es una técnica de contraste donde solo la luz difractada desde el espécimen se usa para formar la imagen. El espécimen aparece brillante contra un fondo oscuro.

La microscopia de campo oscuro crea contraste en especímenes transparentes sin tinción como células vivas. Este depende de controlar la iluminación del espécimen para que la luz central que normalmente pasa a través y alrededor del espécimen se bloquee. En lugar de iluminar la muestra con un cono de luz completo (como en microscopia de campo claro) el condensador forma un cono hueco con luz que pasa alrededor del cono en lugar de pasar a través de este.

Esta forma de iluminación permite que solamente los rayos de luz oblicuos peguen en el espécimen la platina del microscopio y se forme la imagen con rayos de luz dispersados por la muestras y capturados por el objetivo. Cuando no hay muestra en la platina del microscopio la observación

...