Manual para la detección de Mycobacterium Tuberculosis y su resistencia a Rifampicina.

Manual para la detección de Mycobacterium Tuberculosis y su resistencia a Rifampicina.

Objetivo

Detectar la presencia del complejo Mycobacterium Tuberculosis y a si mismo determinar la resistencia a rifampicina en muestras de esputo inducido o expectoración.

Campo de aplicación

La prueba de amplificación de ácidos nucleicos ha sostenido durante mucho tiempo una gran promesa  para el diagnóstico de TB y la rápida detección de la resistencia a las drogas, los ensayos comerciales han sido ampliamente utilizados dentro de los países de altos ingresos por más de 20 años . Sin embargo, a pesar de la alta especificidad, la sensibilidad para el diagnóstico de TB ha sido modesta  y variable en la baciloscopia negativa de esputo y extrapulmonar TB [13-16].Las tasas más altas de TB  con baciloscopía negativa ocurren entre los pacientes infectados por el VIH, y el 80%  de la carga mundial de la tuberculosis asociada al VIH se encuentra en el África sub Sahara , donde la capacidad de diagnóstico de laboratorio está menos desarrollada.

La OMS tomó el paso audaz de aprobar las pruebas de amplificación de ácidos nucleicos para su uso en entornos de recursos limitados, por primera vez en 2008 para hacer frente al desafío de la epidemia de resistencia a los medicamentos global. Con la creciente evidencia de la verdadera magnitud de la epidemia de TB-MDR, ensayos con sondas de la línea molecular fueron aprobados para la detección rápida de la TB resistente a los medicamentos [103]. Sin embargo, estos ensayos son técnicamente demandantes, costosos, el uso está restringido a laboratorios centralizados, y no se recomiendan para probar directamente especímenes clínicos con baciloscopía negativa en vista de la sensibilidad limitada y el riesgo de contaminación cruzada. Por lo tanto, la ampliación y la repercusión de estos ensayos han sido limitadas.

El ensayo recién desarrollado Xpert MTB / RIF supera un número de estas limitaciones. Se utiliza la tecnología de la PCR en tiempo real (RT-PCR) tanto para diagnosticar la TB y detectar resistencia a la rifampicina simultáneamente utilizando especímenes clínicos sin procesar, sin importar el estado del esputo. El ensayo se lleva a cabo dentro de un sistema basado en cartuchos simples, casi totalmente automatizado. La simplicidad para que el usuario haga de este un  ensayo que sea viable podría  llevarse a cabo ampliamente fuera de los laboratorios centralizados y potencialmente impactar sobre el control de la TB.

Secuencias de ADN diana

La resistencia a la rifampicina es particularmente susceptible a la detección molecular rápida desde > 95 % de todas las cepas resistentes a la rifampicina que contiene mutaciones localizadas dentro de la región de núcleo 81 pb del gen rpoB ARN polimerasa bacteriana, que codifica el sitio activo de la enzima . Por otra parte, las mutaciones que se producen en esta región son altamente predictivas de la resistencia a la rifampicina, mientras que los aislados susceptibles casi siempre tienen la misma secuencia de nucleótidos de tipo salvaje [18,19]. Además, la región del núcleo rpoB está flanqueado por secuencias específicas de ADN – Mycobacterium tuberculosis. Por lo tanto, es posible para la prueba de M. tuberculosis y  para la resistencia a la rifampicina simultáneamente,  dirigidas a una única ampliación generada utilizando la tecnología de PCR. Por otra parte, la resistencia a la rifampicina es fuerte, aunque no siempre, es un indicativo de la MDR -TB (definida por la resistencia concomitante a la isoniazida - otro agente clave antituberculoso). La resistencia a la isoniazida, por el contrario, es conferido por las mutaciones en varios genes y es un mal indicador de la MDR -TB desde la  monorresistencia a isoniazida es común. Al dirigirse a los dos más comunes de estos genes, kat G y inh A, utilizando un ensayo de prototipo para probar aislados clínicos de España y los EE.UU., la sensibilidad para la detección de resistencia a la isoniazida sólo fue del 85 % en comparación con el 98 % para la detección de la resistencia a la rifampicina por la orientación del gen rpoB . Por lo tanto, el gen rpoB representa una mejor diana molecular para la detección simultánea de la tuberculosis y la manera clave de resistencia a los medicamentos.

Fundamento

Tecnología Molecular bacon

El ensayo Xpert MTB / RIF  utiliza la tecnología molecular bacon  para detectar secuencias de ADN amplificados en un ensayo de RT-PCR semi-anidado. Cinco diferentes sondas de hibridación de ácidos nucleicos se utilizan en la misma reacción múltiplex . Cada sonda es complementaria a una secuencia diana diferente dentro del gen rpoB  de rifampicina susceptibles M. tuberculosis y se marca con un fluoróforo de diferente color. En conjunto, estas sondas solapantes abarcan toda la región de núcleo 81 pb del gen rpoB .

La zona del núcleo, secuencia diana del gen rpoB y la tecnología de molecular bacon

Molecular bacon son secuencias de oligonucleótidos que contienen una secuencia de sonda insertada entre dos secuencias de "brazo". Las dos secuencias de "brazo" están diseñadas para ser complementarias entre sí de tal manera que, bajo condiciones de ensayo, se hibridan para formar una estructura secundaria de tallo y bucle la sonda se encuentra dentro de la estructura de bucle . Un fluoróforo se une covalentemente a un extremo de un brazo y un extintor no fluorescente a la otra. Con la sonda en su estado no hibridado libre la proximidad del extintor y moléculas de fluoróforo suprimen la fluorescencia. Sin embargo, cuando la secuencia de la sonda se une a su diana de DNA complementaria, la baliza molecular sufre un cambio conformacional. Esto provoca la separación de los dos brazos y el fluoróforo y el extintor molecular, lo que resulta en la aparición de la fluorescencia brillante .

Las sondas de molecular bacon se diseñaron sólo para hibridarse correctamente con cada amplificada de tipo salvaje (sensibles a la rifampicina) secuencias rpoB .

Una mutación dentro de estas secuencias interfiere con la hibridación de tal manera que la integridad conformacional de la sonda puede ser retenido en el estado de no - fluorescente. Por lo tanto, una mutación en cualquier parte de la región del núcleo de los resultados del gen rpoB en cualquiera de aparición retardada (inhibición parcial) o la supresión completa de la fluorescencia de la baliza molecular correspondiente . Utilizando el ADN genómico o lisados ​​de cultivo de un gran número de cepas clínicas de M. tuberculosis,  este ensayo fue creado como prototipo para tener una alta sensibilidad y especificidad para la detección de resistencia a rifampicina [5-7]. Un paso más importante fue el desarrollo de una versión del ensayo que con éxito pudo ser realizado. .

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