Materiales Y Metodos Informe n°5

MATERIALES Y METODOS

el fraccionamiento subcelular comprende dos principales etapas que son la ruptura u homogenización y la segunda de fraccionamiento utilizando marcadores moleculares y una última que seria la observación microscópica de las muestras

el primero procedimiento consistió en el el homogenizado en el cual se uso un homogenizado mecánico el cual realizo la profesora, consistía en tomar un trozo de hígado de pollo manteniéndolo siempre frio y utilizando suero fisiológico para dejarlo libre se sangre luego picar el higado de pollo hasta dejarlo en pedazos muy pequeños para luego dejar el hígado homogenizado, se introduce a un vaso precipitado se muele con la ultra turrax y con la ayuda de una gasa y un embudo se sacan los trozos que no fueron totalmente homogenizado. el liquido (homogenizado) se va a un vaso precipitado el cual se mantuvo en hielo

la siguiente etapa luego de este homogenizado consistió en fraccionamiento propiamente tal, se comenzo agregando 10 ml del homogenizado a un tubo falcón n° 1 y se centrifugo a 2500 rpm por 10 min. al finalizar este proceso tuvimos componentes visible que fueron el pellet (P1) al fondo del tubo y un sobrenadante (S1) en la parte superior, este último fue sacado con un pipeta cuidando no tocar el pellet y fue puesto en un tubo n°2 el cual se centrifugo a 6000rpm por 20 min. al pellet (P1) se le agrego suero y con la ayuda de una pipeta Pasteur se resupendio e inmediatamente se guardo en hielo. luego de la centrifugación de tubo n°2 se obtuvo un nuevo pellet (P2) y un sobrenadante (S2) este ultimo (S2) se descarto por lo cual se boto y se continuo trabajando con el pellet (P2) al cual se le agrego 5 ml de suero y se resupendio luego de esto se centrifugo dicho pellet a 6000 rpm durante 20 min en el cual se obtuvo un pellet (P3) y sobrenadante, dicho sobrenadante fue dispuesto en otro tubo falcon y guardo en hielo y al pellet se le agrego 1 ml de suero, resuspendio y guardo en hielo.

el segundo procedimiento consistió en la observación microscópica en la cual se tomo del (P1) que estaba guardado en hielo y con la ayuda de una pipeta se agrago una gota de este en un portaobjetos luego se cubrió con un cubre objetos, el siguiente paso era tomar una gota de este mismo pellet y agregarle una gota de azul de tripal, colocarla sobre el portajetos y cubrir con el cubreobjetos luego estas dos muestras de pellet con y sin azul de tripan fueron observadas a través del microscopio con un lente objetivo 40x

en el tercer procedimiento se ocuparon 4 tubos de ensayos los cuales se rotularon previamente (blanco, fraccion nuclear, fraccion mitocondrial y fracción microsamal) y colocados en hielo, posteriormente a cada uno de los tubos de le agrego 1 ml de succinato, 1ml de azul de metileno y 1 ml de agua destilada y luego al 2do tubo (fracción nuclear) se le agrego pellet 1, al 3er tubo se le agrego Pellet 3 y a ultimo se le agrego sobrenadante

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