Mejora de la expresión de Factor IX humano recombinante por coexpresión de GGCX, VKOR y Furi

Mejora de la expresión de Factor IX humano recombinante por coexpresión de GGCX, VKOR y Furi

concentrados de FIX humano recombinante (rhFIX) son esenciales en el tratamiento y prevención de hemorragias en el trastorno de la coagulación hemofilia B. Sin embargo, debido a la naturaleza compleja de FIX rendimientos de producción son bajos lo que conduce a altos costes de tratamiento. Aquí se presenta la producción de rhFIX con sustancialmente más alto rendimiento mediante la coexpresión de FIX humano con GGCX (c-glutamil carboxilasa), VKOR (vitamina K epóxido reductasa) y furina (aminoácido emparejado enzima de escisión de base) en las células de ovario de hámster chino (CHO). Nuestros resultados muestran que controlado co-expresión de GGCX con FIX es crítica para obtener un título alto rhFIX, y, que la co-expresión de VKOR aumenta aún más el rendimiento de rhFIX activo. Furina coexpresión mejora del procesamiento del péptido líder de rhFIX pero tuvo un efecto menor sobre el rendimiento de rhFIX activo. El nivel de expresión óptima de GGCX fue sorprendentemente baja y requiere la ingeniería inusual de elementos del vector de expresión. Para VKOR y furina el control de la expresión era menos crítica y se puede lograr por el elemento de vector estándar. Utilizando nuestro vectores de expresión Se obtuvo un clon de rhFIX productoras con un nivel de expresión de hasta 30 mg / L de rhFIX activo. Además se desarrolló un método de un solo paso purificación eficiente para obtener rhFIX pura y activa con el rendimiento hasta un 94%.

abreviaturas

FIX Factor IX

CHO ovario de hámster chino

GGCX c-glutamil carboxilasa

ácido glutámico Gla c-carboxi

VKOR vitamina K epóxido reductasa

Furina / PACE Emparejado aminoácido básico escisión enzimática

PTM post-traduccionales modi fi caciones

electroforesis en gel de SDS-PAGE SDS-poliacrilamida

RT-PCR RT-PCR

ELISA ligados a una enzima ensayo inmunoenzimático

espectrometría de masas EM

HPLC chromatograhy líquida de alta resolución

Introducción  

factor de coagulación IX (FIX) es una proteína plasmática de 55 kDa que tiene un papel esencial en la coagulación de la sangre. Deficiencia de FIX conduce a la hemofilia B, que es un trastorno hemorrágico caracterizado por coagulación alterada y una mayor tendencia a sangrar. La hemofilia B es causada por mutaciones que afectan al gen FIX ligado cromosoma X, y se produce en 1 de 30.000 varones nacidos [1, 2]. En los pacientes con hemofilia B, hemorragias suelen ser recurrentes y suelen afectar a las rodillas, los tobillos y los codos. Las complicaciones incluyen la artropatía hemofílica, dando como resultado dañados, dolor en las articulaciones y la movilidad restringida [3]. Con la excepción de los pacientes con formas leves de la enfermedad, el tratamiento o la prevención de episodios de sangrado en pacientes con hemofilia B se basa en la inyección de la coagulación factor IX concentrado [4, 5]. Los factores de coagulación de reemplazo se obtienen típicamente a partir de plasma humano agrupado o de preparaciones recombinantes [3]. La administración de proteínas purificado a partir de plasma confiere un riesgo de transmisión de agentes infecciosos, y, el suministro de materia prima adecuada es limitado. La producción de FIX humano recombinante (rhFIX) para uso médico sin embargo, no es una tarea sencilla, y en la actualidad existe un único producto en el mercado, Bene fi x [6]. Por lo tanto, la disponibilidad de rhFIX seguro y rentable concentra todavía constituye una necesidad médica insatisfecha.

FIX se sintetiza en el hígado como un zimógeno que se convierte en una serina proteasa después de la activación en plasma. Antes de que se secreta en el plasma, FIX sufre varios cationes complejos modificación posterior a la traducción fi (PTMs), incluyendo c-carboxilación de 12 residuos de ácido glutámico N-terminal, N y O-glicosilación, fosforilación, b-hidroxilación, sulfatación, disulfuro de bonos formación, y proteolítica de procesamiento del péptido señal y el propéptido. REVISIÓN maduro consta de cuatro dominios distintos: el N-terminal de dominio Gla, el dominio EGFlike, el dominio del péptido de activación (AP) y el dominio de la proteasa serina C-terminal. Entre los PTMs requeridos es carboxilación de residuos de ácido glutámico para formar ácido c-glutámico (Gla) en el dominio Gla, lo que es un reto importante en la obtención de la expresión de alto título de rhFIX completamente funcional [7]. En este trabajo se describe la ingeniería de una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) mediante la introducción de tres enzimas modificadoras adicionales de apoyo c-carboxilación y el procesamiento proteolítico de FIX, lo que mejora drásticamente la productividad de rhFIX completamente funcional.

Materiales y Métodos 

Materiales 

células CHO-S, medios de cultivo celular incluido el medio CD-CHO, G418, Lipofectamine 2000, no esencial suplemento de aminoácidos, suplemento de HT, ADNc de hígado humano, pcDNA3.1V5 vector de mamífero / Su, pcDNA3.1Hygro, pcDNA3.1 ?, pZeoSV2 ?, Pfx ADN polimerasa, polinucleótido quinasa de T4 se adquirieron de Invitrogen. Konakion? de Roche se utilizó como una fuente de vitamina fragmentos de ADN de oligonucleótidos K., ácido fórmico, Tris-HCl, ditiotreitol y yodoacetamida se adquirieron de Sigma-Aldrich y acetonitrilo era de Fisher química. La tripsina se adquirió de Promega y Arg-C y LysC eran de Roche Diagnostics. Factor IX ZYMUTEST ELISA kit y kit de ensayo BIOPHEN Factor IX eran de GUIÓN BioMed. ROX Factor IX kit de ensayo de actividad era de Rossix (Mo ¨lndal, Suecia).

Construcción de vectores de expresión  

Todos los métodos de clonación fueron acuerdo con métodos estándar y / o los procedimientos recomendados por el fabricante.

NOPA y hglx vector de clonación 

El ADN que codifica GGCX humano era amplifica a partir de ADNc de hígado usando cebadores hglx5 (50-TCCGCAGAGCAATGGCGG TGTCT-30) y hglx3 (50-CCAACATCTGGCCCCTTCA GAACT-30). El producto de PCR fue GGCX primero clonado en el TA-TOPO vector tratado pcDNA3.1V5 / His (Invitrogen). GGCX codificación de cDNA bajo el control del promotor SV40 se obtuvo por transferencia del fragmento que codifica GGCX de pcDNA3.1V5 / His-TOPO TA a la pZeoSV2 + vector, utilizando las enzimas de restricción BamH1 y NotI. Se eliminaron los sitios de restricción EcoRV-NotI corriente abajo del inserto de GGCX. a continuación, un fragmento ClaI-BclI romo de allí resultante pZeoSV2-GGCX plásmido (que contiene el promotor SV40 y la GGCX que contiene de inserción, pero no el sitio de poliadenilación y la señal de poliadenilación aguas abajo de la secuencia que codifica GGCX) se clonó en el sitio romo DraIII restricción de pcDNA3 .1+. Un clon con el fragmento de pSV40-GGCX insertado en tándem (misma dirección transcripcional) en relación con el promotor CMV fue seleccionado (pNopA) .El vector hglx se construyó similar a la del vector NOPA, pero con el fin de dar niveles más altos GGCX la señal de poliadenilación de pZeoSV2? fue incluido en el fragmento de pSV40-GGCX-pA se clonó en el sitio de DraIII romo de pcDNA3.1, y, un clon con el fragmento de GGCX que contiene en el orden inverso en comparación con el vector NOPA fue seleccionado.

Expresión FIX vectores F9NopA y F9hglx 

el factor IX de coagulación humano cDNA (GenBank NM_000133) fue amplificado a partir de ADNc de genes humanos piscina hígado (Invitrogen) utilizando oligonucleótidos f9f. AMPL (50-CACCATGCAGCGCGTGAACATGAT-30) y F9r.ampl fragmento (50-CCTTGGAAATCCATCTTTCATTA-30) .El FIX humano fue amplificado por PCR utilizando ADN polimerasa Pfx. El producto de PCR de extremos romos se fosforiló usando polinucleótido quinasa de T4, y se clonó en el EcoRV digerido y fosforilado-de pcDNA-GGCX vectores NOPA y hglx, para dar F9NopA y F9hglx, respectivamente. secuencias del vector de expresión del final están disponibles en GenBank con los números de JA237977 para F9hglx y JA237976 para F9NopA.

higro vector VKOR 

La secuencia de codificación de VKOR fue PCR amplificado a partir de ADNc de hígado humano (Clontech) usando los cebadores: VF1 (50-CACCATGGGCAGCACCTGGGGGA-30) y VR1 (50GCTCAGTGCCTCTTAGCCTT-30) y TA-TOPO se clonó en pcDNA3.1-V5 / His (Invitrogen). La secuencia de codificación de VKOR fue liberado por HindIII y NotI y después subclonado en el vector pcDNA3.1Hygro usando las mismas enzimas de restricción para dar construir pVKORhygro (GenBank DM079693 adhesión).

Vector pZ eoSV2-furina 

La furina humana / PACE secuencia codificante se clonó en pZeoSV2 (+) vector (Invitrogen), utilizando la A fl II y de restricción EcoRV sitios para obtener pZeoSV2-furina (GenBank KF886270). Las secuencias de codificación correctos de FIX, GGCX, VKOR y furina se confirmaron por secuenciación de ADN.

Desarrollo de líneas celulares FIX humano 

células CHO-S se cultivaron en DMEM F12 con GlutaMAX y 10% de FBS, y se transfectaron con F9NopA linealizado o F9hglx de acuerdo a las recomendaciones de Invitrogen. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos con medio selectivo que contenía G418 el día después de la transfección. La detección de la expresión rhFIX hecho por ELISA. La mejor piscina FIX clon que produce se sometió a clonación por dilución límite. Durante la expansión clones se seleccionaron para la expresión en varias ocasiones rhFIX usando un ELISA. Se seleccionaron tres clones por constructo y adaptadas al crecimiento en medio libre de suero. Después de la adaptación, los clones se evaluaron y se compararon sobre la base de las propiedades de crecimiento y el nivel de expresión rhFIX (utilizando tanto ELISA y análisis de transferencia Western). El mejor clon N4D5 se encontró a partir de las células transfectadas F9NopA. a continuación, el clon N4D5 se transfectadas con el constructo VKORhygro, linealizado con SspI, e higromicina clones resistentes fueron seleccionados y se seleccionan para mejorar la productividad tanto con ensayo de actividad de FIX y ELISA. Después de limitar la clonación de dilución y ensayo de productividad se eligió el clon A2F8 para estudios adicionales. La línea celular se transfectó con A2F8 pZeoSV2-furina, linealizado por la enzima de restricción SspI. Después de la selección de zeocina, piscinas oligo-clonales estables fueron seleccionados para la mejora de la productividad arreglo mediante un ensayo cromogénico FIX (ROXFIX) y el clon 2F6 fue seleccionado y crio-conservados en un medio CD-CHO con un 5% de DMSO.

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