Metodología Extracción de ARN planta

Universidad de concepción[pic 1]

Campus los Ángeles, Ing. Biotecnología Vegetal, Genética y Biotecnología

Alejandra Daza, Claudia Jara, Natali Salcedo.

Materiales

• Espectrofotómetro termo scientific Germany 10 uv.
• Centrifuge Boeco Germany M-240R.
• Vortex Mixer VM-300.
• Thermoblock Boeco Germany MSM-420.
• Micropipetas arquimed 10µl-100 µl.
• Transiluminador.
• Cámara de electroforesis para ADN y ARN.
• Mortero.
• Ependorff 1,5 ml.
• Puntas amarillas y azules.
• Cámara de electroforesis

Metodología

Extracción de ARN planta

El ARN total fue aislado  a partir de la especie Colobanthus quitensis donde el tejido se maceró en nitrógeno líquido luego se procedió a pulverizar hasta que quedara bien molido, de la muestra obtenida se ocupó aproximadamente  100 mg del tejido,  posterior a esto  se procedió a añadir  la solución de Chomczynski con fenol. Se centrifugo y se obtuvo un  sobrenadante al que  se le añadió 0,2 mL de cloroformo frío. Esta mezcla se centrifugó a 12000 rmp  a 4°C durante 15 min y la fase acuosa se transfirió a un nuevo tubo, se le agregó 0,5 mL de isopropanol frío. Se centrifugó a 12000 xg a 4°C por 15 min y el precipitado resultante fue lavado con etanol al 75% y secado a temperatura  ambiente. El material seco se resuspendió en 50 µL de ADESI con DEPC y se almacenó a -70°C.

Determinación de la concentración, pureza e integridad del ARN y ADN

Para conocer las concentraciones del ARN y ADN se prepararon diluciones de cada uno de los ácidos nucleicos. Se tomó de ---- ARN y de ADN y se diluyó en ----  µL de ADESI-DEPC en el caso del ARN y en ADESI en el caso del ADN. Se midió la absorbancia a 260 nm y 280 nm en un espectrofotómetro. Una vez que se obtuvieron los valores de absorbancia del ARN y ADN, a partir de las siguientes ecuaciones se conoció sus concentraciones:

• Concentración de ARN (µg/µL) = (Abs260) (Factor de dilución) (40) / 1000
• Concentración de ADNp (µg/µL) = (Abs260) (Factor de dilución) (50) /1000

Se emplea el cociente Abs260/280  para calcular la pureza del ARN total. Un ARN total puro presenta una relación aproximada a 2.0 (Leite et al., 2012).

Para determinar la integridad del ARN total extraído, se sometió la muestra a electroforesis en gel de agarosa 0,4 gr y 0,5 µM de  TAE 1X con DEPC teñido con  4,5 µM de  gel red. Se mezclaron 4µL de la muestra de ARN con 2,5 µL de buffer de carga azul-celeste 6x. La electroforesis se llevó a cabo a 100 volts durante 25 minutos. El ARN se observó en un transiluminador con luz ultravioleta.

Para establecer la integridad del ADN, se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1%. Se mezclaron 4µL de la muestra de ADN con 2,5µL de buffer de carga azul-celeste 6x. La electroforesis se llevó a cabo a 100 volts durante 25 minutos. El ADN se observó en un transiluminador con luz ultravioleta.

Amplificación del gen constitutivo 18s ADN  de tabaco  mediante PCR.

En un tubo de PCR (0,2 ml) bien identificado se hace un mix en el cual se adiciona  Buffer de reacción de la enzima (Taq) a una concentración final de 1%, dNTPs a una concentración final de 0.2 mM, ambos primers a una concentración final de 0,5 µM, 1 µl del DNA, ADESI hasta un volumen final de 15 µl y finalmente Taq polimersa a una concentración de 1,25 U. esto se hace en base a los cálculos realizado por la laborante se mezcla bien y luego se lleva a termociclador para poder amplificar la secuencia de ADN extraída, posterior a esto, se realiza electroforesis técnica utilizada en el practico Determinación de la concentración, pureza e integridad del ARN y ADN.

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Resultados

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Se analizaron una muestra de ARN obtenido de una especie vegetal  con el protocolo de Chonsisky  para extraer simultáneamente RNA total en lo cual.se valoró sometiéndolo a electroforesis en gel de agarosa al 1%. Como se observa en la imagen Nº1 en el carril Nº4  se observan 3 bandas de ácidos nucleicos, la primera corresponde al DNA  remanente, la segunda al RNA ribosómico 28S y la tercera al RNA ribosómico 18S (aunque el ARNr no es muy apreciable en la imagen)  y la última banda es ARNt o ARN de transferencia por lo que al ser menos compactado recorre mucho más rápido el gel de agarosa (Amaru, r. et all, 2008). Por  tanto, la muestra de ácidos nucleicos obtenidos en el laboratorio no es muy pura. Esto puede deberse a la presencia de productos fenólicos, pigmentos y/o proteínas no eliminadas en el proceso de extracción (Rodriguez-García et al., 2006).

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